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1、1,第十章 感染性疾病的临床分子诊断,2,课程内容,病毒性疾病的临床分子诊断细菌性疾病的临床分子诊断特殊病原体的临床分子诊断医院感染的临床分子诊断,3,收集临床标本,形态学检查,分离培养及鉴定,动物试验,生化反应,药敏试验,血清学鉴定,形态学鉴定,免疫学检测,传统病原体的检验程序,4,微生物学检验,发现传染源的最主要手段病原体诊断的金标准检测时限长（242天）某些病原体不能被培养受多种因素影响,5,分子诊断,严格病原体不可培养或难以培养的病原体需要快速得到检验结果需要获得定量数据,Why？,6,第一节 病毒性疾病的临床分子诊断,人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占
2、人类传染疾病的75%左右。400多种不同病毒。病毒结构：大 小：20-300nm 核心区：核酸（DNA或RNA）外周衣壳：蛋白质 包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）,病毒的概况：,7,我国是HBV高流行区，50%70%的人受过感染，8%12%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV又与原发性肝癌密切相关。外壳（HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原 核心（HBcAg)：DNA DNA 聚合酶 HBcAg,一、乙型肝炎病毒,8,3.2kb双链DNA病毒 不完全双连环状DNA 长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、X S区编码外膜蛋白（HBsAg）C区编码HBeAg、HBcAg
3、 p区编码DNA聚合酶 X区位编码X蛋白，可能与病毒蛋白表 达有关。短链S为正链：长短不一,（一）乙型肝炎病毒基因组结构,9,pre-s1,pre-s2,S,P,C,pre-c,X,HBV DNA 3.2 kb,pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg,HBV基因组结构,10,乙型肝炎病毒的复制周期,11,（三）乙型肝炎病毒的基因分型,对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型进行描述。根据 HBsAg 抗原性差异，将HBV分为10个血清型，其中主要的有adr、adw、ayw和ayr。
4、血清型分布有明显的地区与种族差异，和国汉族以adr为主，adw次之。根据HBV全核苷酸序列差异在8%或以上，或S基因序列差异在4%或以上的原则，可将HBV划分为不同的基因型，目前已经发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。,12,我国流行的主要是A、B、C、D四种HBV基因型，另有混合型。,四种HBV基因型在中国地域分布的主要概况HBV基因型 主要分布地域A基因型 仅见于少数地区(广西壮族自治区)B 基因型 长江以南C基因型 长江以北D基因型 少数民族较多的地区(西藏、新疆、宁夏等),13,病毒分型检测的意义HBV基因型与HBV流行病学特点
5、、HBV标志物的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对药物的敏感性有关。不同基因型对抗病毒药物的效果存在一定差异用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型B比基因型C 有更好的应答：用普通IFN-a治疗时，基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高。,14,（三）HBV核酸检测,常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。1.普通PCR技术 传统PCR方法检测HBV DNA的灵敏度可以达到ng级水平，检测结果能直接反应HBV病毒的复制程度，为临床提供从分子水平上对病原体进行诊断提供依据。,15,引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P 和X 基因中的高
6、度保守序列来设计。不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴化乙啶的使用等。,16,扩增位置 引物序列 扩增片断（bp)P、X基因 5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3 278 5-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3 C基因 5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3 477 5-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3 C基因 5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3 258 5-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3,17,2荧光定
7、量PCR技术荧光定量PCR法的应用，可以在在进行HBV DNA检测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内HBV的复制及传染性有更直接的了解，能准确地反映HBV DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。其特异性高，灵敏度可达001fg，检测范围为2.51022.5109copies/ml。,18,19,HBV核酸检测的意义,1.早期诊断 免疫学检测敏感性：0.1g/ml 核酸杂交检测敏感性：0.1pg/ml PCR检测：0.1fg/ml 因此，在感染早期即可通过DNA检测证实病毒的存在。,20,2.监测治疗效果:HBVDNA107拷贝/ml提示病毒复制活跃；HBVDNA104拷贝/ml
8、治疗有一定疗效；HBVDNA103拷贝/ml、HBeAg阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；3.判断病情，指导制定合理的治疗方案,21,常用的抗HBV药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中，部分患者对药物产生了耐药性。HBV一旦出现耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增加，服药 5 年的耐药性可高过约69%。因此，对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药和监测病情等方面都具有重要意义。,HBV的耐药突变和检测,22,乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是HBV本身是一种变异较高的病毒。HBV在复制过程中必须经过经过RNA中间
9、体的逆转录过程中，由于HBV DNA 多聚酶具有逆转录酶的性质，即缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达10-5。慢性HBV感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。人体免疫应答或疫苗接种等压力下HBV也可发生突变。突变引起病毒生物学特性的改变，使慢性HBV感染患者体内积累了大量基因序列突变的HBV株，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的以改变(免疫逃逸)及药物抗性等，给HBV感染的临床表现、诊断、预后及防治等方面带来一系列复杂的问题。,23,拉米夫定一种能抑制乙型肝炎病毒复制的核苷类药物，其作用机制：核苷(酸)类似物与HBV DNAP的自然底物(dNTP)竞争地与该酶结合,
10、导致HBV DNA合成终止，达到抑制 HBV 复制的目的。所以与HBV DNAP 结合能力的强弱决定了该类药物的疗效。,24,当HBV DNAP氨基酸序列发生改变并影响到其空间构象发生改变时，使HBV DNAP与核苷（酸）类似物的结合能力明显下降，于是就产生了对核苷酸类药物的耐药性，发生耐药现象。在拉米夫定抗HBV感染治疗中，HBV发生变异最为常见，这些变异发生在HBV DNAP的基因区。拉米夫定抗病毒治疗的靶点在HBV DNAP的逆转录酶区。,25,HBV YMDD变异直接测序结果图谱,26,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,27,DNA芯片技术诊断HBV YMDD变异,28,结核分
11、枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。,第二节 细菌性疾病的临床分子诊断,29,30,结核分枝杆菌,1.生物学特性
12、与致病性 结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病 人型结核分枝杆菌感染的发病率最高,31,生长与病理特征,结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需1520小时，生长成可见菌落一般需46周 在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤,32,33,肠结核,34,2.基因组特点 共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4Mb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因,结核分枝杆菌,35,(1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有
13、复合群特异性(2)蛋白质编码基因(3)rRNA基因：每个细胞约含有103104 个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列,基因组特征,36,实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法 分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测,结核分枝杆菌的检测,37,38,39,聚合酶链反应(PCR)Real-time PCR染色体核酸指纹法线性探针杂交法16s23srDNA(rRNA)序列法基因芯片技术,分子生物学检验方法,40,耐药基因的检测：,已查出的结核杆菌耐药基因有rpoB(对
14、利福平)，Kat、inhA、ahpC(对异烟肼)，embl(对乙胺丁醇)，rpsL、rrs(对链霉素)，pncA(对吡嗪酰胺)和gyrA(对氟喹诺酮类，gyrB则为低度耐药)等。,41,42,线性探针耐多药检测方法（HAIN）,适用范围：1、TB的诊断2、一线抗结核药物耐药诊断3、二线抗结核药物耐药的诊断4、目前，利福平（rpoB基因）、异烟肼（Kat基因、inhA基因）耐药的诊断所需仪器设备：生物安全柜、超声振荡仪、PCR扩增仪、可调温振荡仪,43,原理：基于分子生物学扩增与探针技术。rpoB基因突变位点有：4个Kat基因、inhA基因突变位点有：2个、4个,44,正确流程,杂交,DNA提取
15、,MIX制备,痰液前处理,45,操作步骤,一、痰标本处理去污染前处理液：氢氧化钠+柠檬酸三钠+N-乙酰半胱氨酸。痰标本+等体积去污染前处理液：振荡-离心-静置-PBS清洗-离心-留取沉淀。二、DNA提取处理后痰标本沉淀：95C孵育-超声裂解-取上清液用于PCR扩增。三、扩增产物杂交PCR产物变性，与探针试条上的标记突变位点杂交，标记物显色。,46,四、结果判读,试剂质控,位点质控,47,48,49,HAIN和目前常规药敏方法比较,50,适用范围：1、TB复合群鉴定。2、TB菌种鉴定。3、利福平和异烟肼耐药检测。原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。,基因芯片鉴定与耐药性检测技术,51,基因芯片
16、,将核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列。采用光导原位合成或微量点样等方法。与已标记的待测生物样品中靶分子杂交。通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。,52,耐药检测基因芯片,基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性（利福
17、平、异烟肼）。rpoB基因突变位点：13个位点。katG基因突变位点：2个位点。/inhA基因突变位点：2个突变位点。,53,耐药分子诊断的基本原理,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,结核和利福平耐药的快速分子鉴定（x-pert）,适用范围：1、TB复合群鉴定。2、利福平耐药检测。原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。可以在2小时出报告结果。,66,67,人乳头瘤病毒（HPV）是一种嗜上皮性病毒，具有高度的组织和宿主特异性及将正常细胞永生化能力。可致人类皮肤黏膜异常增生，引起良性肿瘤和疣，如寻常疣、尖锐湿疣、乳头状瘤；或导致癌变，如阴道癌、宫颈癌等，是一种
18、常见的性传播性疾病。,电镜下HPV,HPV是一种无包膜的双链闭环的小型DNA病毒。球形，直径52-55nm。由DNA核心和蛋白衣壳组成。衣壳由主要衣壳蛋白(L1)和次要衣壳蛋白(L2)组成。,第三节 特殊病原体的临床分子诊断,68,一、人乳头瘤病毒的基因组结构特征(一)病毒人乳头瘤病毒基因组结构HPV基因组可分为三个区段：早期区（E）、晚期区（L）及长控制区（LCR）或称上游调节区（URR）或非编码区（NCR）。早期区长约4Kb，分为E1E8开放阅读框，其中E3和E8不是所有病毒基因组都有，尚未发现它们为病毒蛋白编码。晚期区约3000bp，有两个主要ORF，分别称为L1，L2，与E区的转录方向
19、一致。长控制区位于E区和L区之间，长约1000bp。不同的HPV亚型的L区DNA序列变异很大，为不同亚型分型的重要标准之一。,69,二、人乳头瘤病毒的分子生物学检验,（一）人乳头瘤病毒核酸检测1.核酸杂交 采用核酸杂交技术检测 HPV DNA，具有较强的特异性，并可以分型。目前常采用HCII技术、核酸杂交技术与PCR相结合的方法，能获得最佳检测结果。（1）HC-II检验系统：原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。,HC-II 基本实验步骤图示,70,临床上常见的HPV核酸诊断系统,71,（2）核酸杂交技术与PCR结合法：常用通用引物-PCR（GP-PCR）反向线性杂交技术、分子导
20、流杂交技术和PCR酶标微孔板杂交技术。（3）侵染检测技术2、PCR技术（1）GP-PCR法（2）实时定量PCR法3、基因芯片技术4、流式荧光液芯技术5、飞行时间质谱技术,72,特点,检测项目低危亚型：6、11、40、42、44、61、73 高危亚型：16、18、31、33、35、39、45、52、58、26、51、55、56、59、53、66、68、82、83共26种亚型，囊括所有常见生殖道致病HPV亚型 液芯技术，全部亚型，一次呈现 明确分型，直接以亚型报告结果 检测过程无须洗涤 灵敏度高，检测低限仅为6-10copy/ml 杂交仅需15分种,73,（二）人乳头瘤的分型已发现约110余种HP
21、V，近40种型别与生殖道感染有关。根据不同型别HPV与癌症发生的危险性高低将人类感染性HPV分为高危型和低危型两大类。只有高危型HPV持续感染才有患高度宫颈病变的风险，高危型HPV约为20种，最经典的有13种。不同地区人群感染率及感染型别不同，不同HPV感染型别与宫颈癌发生的相关性不尽相同。高危型别、高病毒载量、持续感染是促使宫颈癌发生的重要因素。,74,三、HPV分子诊断的临床意义（一）宫颈疾病风险预测HPV DNA检测发现高度病变的敏感度为98%100%，是宫颈癌筛查的优选方法。根据感染的HPV类型预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔。当细胞学和HPV检测均为阴性时，阴性预测值可达99%
22、100%，发病风险很低，筛查间隔可长至5年；细胞学阴性或而高危型阳性者，宫颈癌发病风险较高，应定期随访。在诊断意义不明确的不典型鳞状细胞/腺细胞和鳞状上皮内低度病变，HPV DNA检测是一种有效的再分类方法。重复感染同一高危型HPV将使其癌变的机会增加，连续两次HPV分型检测显示单一型别高危亚型的感染，预示宫颈癌发生的可能性增大。,75,（二）疗效评估及术后跟踪在HPV的感染治疗前后，出现病毒量或感染型别的变化，可作为治疗效果的评估指标和恢复评价。术后或治疗后6个月分型检测结果阴性，则说明手术或治疗成功；HPV分型结果为阳性，且感染型别与之前相同则说明有残留病灶并有复发的可能，而感染型别为不同
23、亚型，则说明出现新的感染。,（三）预防控制及疫苗研发对不同地区人群感染的HPV分型检测，可分析不同地区HPV感染的流行状况，有利于各地HPV感染的预防控制和针对性的开发HPV预防性疫苗。,76,第四节 医院感染的临床分子诊断,住院患者在医院内获得的感染易感人群包括婴幼儿、基础疾病患者和有危险因素者分布有显著地区差异常为多重耐药菌，治疗难度大检验的关键是了解院内病原菌的分布和亲缘关系,77,脉冲场电泳技术（PFGE）,目前分子分型“金标准”敏感、特异、重复性高、分辨率高征对整条染色体分型,78,PFGE,细菌的染色体,稀有酶切位点,限制性内切酶消化,电泳,79,+,+,+,+,+,+,+,+,-
24、,-,-,-,-,-,-,-,Electric Field 1,Electric Field 2,Switch Time,CHEF,80,81,82,动物、肉类和人的多重耐药Newport沙门菌分离株的PFGE图谱,83,多位点序列测定（Multi-Locus Sequence Typing，MLST）,84,分型的基础：细菌基因组内位于同一位点的看家基因的片段是否存在变异看家基因的测序不同的等位基因指派一定的数值，生成等位基因谱 每个等位基因谱认定为一个序列型（ST）进化树确定亲缘关系,85,看家基因扩增,MLST分型方法实验流程,86,eBURST 软件分析菌株之间的亲缘关系,5株均属于ST1克隆复合体,87,88,
