《临床生物化学检验技术 11 第11章 体液中酶的生物化学检验课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《临床生物化学检验技术 11 第11章 体液中酶的生物化学检验课件.ppt（169页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、临床生物化学检验技术,第十一章 体液中酶的生物化学检验,贵阳医学院 潘卫,本章思考题,简述血清酶的分类简述血清酶含量变化的机制简述影响血清酶变化的因素简述ALT、AST、CK、LDH、GGT、AMY、ChE的项目检测依据,思考题,本章思考题,简述ALT、AST、CK、LDH、GGT、AMY、ChE的临床意义、检测原理以及方法学评价简述同工酶及其亚型检测的临床意义,思考题,目录,第一节 概述第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶（ALT、AST、-GT、CK、LDH、ALP、ACP、AMY、LPS、ChE、5-NT、LPL、MPO）第三节 酶学检测在临床上的应用,目录,第一节 概述,重点提示,1.明
2、确血清酶的分类2.了解血清酶的变化机制3.掌握影响血清酶的变化因素,重点,在已知的3000多种酶中证明人体内存在的至少2000多种。当细胞缺氧、炎症、损伤或实质细胞数量变化时，血浆中酶的含量会发生明显变化，这种变化可以提示病变的部位和严重程度。因此，全面了解酶的分类、变化机制以及影响因素有助于对酶含量变化做出合理解释,第一节 概述,概述,一、血清酶的分类,除凝血酶和纤溶酶外，血清酶与血浆酶基本一致。根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，可将血浆酶分成血浆特异酶和非血浆特异酶两大类。前者主要指在血浆中发挥特定的催化作用的酶，也称血浆固有酶。它们以酶原形式分泌入血，在一定条件下被激活，引起相
3、应的生理或病理变化,血清酶的分类,一、血清酶的分类,血浆特异性酶大多数在肝脏合成，当肝功能减退时，可见血浆中这些酶活性降低。属于这一类性质的酶还有胆碱酯酶、铜氧化酶（铜蓝蛋白）和脂蛋白脂酶等,血清酶的分类,一、血清酶的分类,非血浆特异酶在血浆中浓度很低，并且在血浆中很少发挥催化作用。可进一步细分为外分泌酶 细胞酶,血清酶的分类,一、血清酶的分类,外分泌酶来源于消化腺或其他外分泌腺，如胰淀粉酶、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关,血清酶的分类,一、血清酶的分类,细胞酶存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随细胞的新陈代谢，有少量酶释入血液
4、。其中大部分无器官专一性，只有小部分来源于特定的组织，有器官专一性。这类酶细胞内外浓度差异悬殊，病理情况下血浆中极易升高，其下降的临床意义很少。这些酶最常用于临床诊断，如丙氨酸氨基转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等,血清酶的分类,二、血清酶的变化机制,正常情况下，组织细胞内发挥催化作用的酶在血清中含量甚微，组织器官受损造成细胞破坏或细胞膜通透性增高时，细胞内的某些酶大量释放入血；细胞的转换率增高或细胞的增殖加快，其特异的标志酶可释放入血；细胞内酶的合成或诱导增强或酶的清除受阻也可引起血清酶活性升高,血清酶的变化机制,二、血清酶的变化机制,血清中酶的清除方式与其他血浆蛋白质类似血清酶的半寿期是指酶失
5、活至原来活性一半时所需时间（T1/2），可以表示酶从血中清除的快慢。不同血清酶甚至血清酶的同工酶之间半寿期差别很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异,血清酶的变化机制,二、血清酶的变化机制,常见的几种血清酶的半寿期与分子量,三、影响血清酶的因素,（一）生理变异 包括性别、年龄、饮食、运动、妊娠等多个方面（二）病理变化 许多疾病会导致血清酶水平的改变，其对疾病的诊断和监测有重要价值。详见本书相关章节,影响血清酶的因素,（一）生理变异,性别 多数血清酶的男女性别差异不大，但少数酶如肌酸激酶（creatine kinase，CK）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，
6、ALP）及-谷氨酰基转移酶（-glutamyl transpeptidase，-GT）等有性别差异，男性高于女性,生理变异,（一）生理变异,年龄 如新生儿血清中ALP略高于成人，15岁增至成人的23倍，然后逐渐下降，到1015岁，ALP又明显升高，可达成人的35倍，20岁后降至成人值。此外，CK、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）也随年龄而变化,生理变异,（一）生理变异,饮食 血清中大多数酶不受进食的影响，故测酶活性不一定需要空腹采血。但高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。而酗酒可使血清-GT升高，如未累及肝
7、脏，戒酒后酶活性下降。此外，禁食数天可导致血清-淀粉酶（-amylase，AMY）下降,生理变异,（一）生理变异,运动 激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、醛缩酶（aldolase，ALD）和CK、LDH等活性升高，升高幅度与运动量、运动时间、运动频率及骨骼肌所含酶量有关,生理变异,（一）生理变异,妊娠 妊娠时随着胎盘的形成和长大，胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LDH和ALT（少数）等，引起血清中这些酶升高,生理变异,
8、（二）病理变化,酶合成异常 包括合成减少和合成增多，是影响血清酶变化的重要因素，这些酶大多数是在肝脏中合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。此外酶基因变异也可引起特定酶减少或消失,病理变化,（二）病理变化,酶释放增加 酶从病变（或损伤）细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面细胞内、外酶浓度的差异：非血浆特异性酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，只要少量细胞受损，酶从细胞中释放，就可使血清酶明显升高,病理变化,（二）病理变化,酶释放增加 酶从病变（或损伤）细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面酶在细胞
9、内的定位和存在的形式：胞质中游离的酶如ALT、LDH最容易释放入血，而在亚细胞结构中的酶则较难释放出来，特别是线粒体酶,病理变化,（二）病理变化,酶释放增加 酶从病变（或损伤）细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因包括以下几个方面酶蛋白分子量的大小：试验证明酶释放的速度大约和分子量的大小成反比，次因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响，例如LDH分子量大于CK，而当心肌梗死时，LDH在血液中升高的时间就晚于CK,病理变化,（二）病理变化,酶清除异常 不同的疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半
10、寿期以及一些其他因素有关,病理变化,第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶,重点提示,掌握各个酶的检测方法、检测原理、方法学评价熟悉各个酶检测的注意事项、参考区间以及临床意义,重点,血浆中的代谢酶与某些特定组织器官疾病的相关性引起了人们的重视，并进行了深入的研究，使诊断酶学得到了快速的发展。本节将重点介绍临床上常用酶与同工酶的测定方法及临床意义,第二节 临床诊断中常用的酶与同工酶,临床诊断中常用的酶与同工酶,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,（一）检验项目项目检测依据 丙氨酸氨基转移酶（ALT），也称谷丙转氨酶（GPT），是一种参与人体蛋白质新陈代谢的酶，加快体内蛋白质氨基酸在体内转化ALT广泛存在于肝
11、脏、心肌、骨骼肌、肾、脑、胰、肺，白细胞和红细胞中，以肝脏中的含量最多。这些组织发生损伤或坏死时，酶从这些组织细胞中释放，致使血清中的ALT活性升高,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,临床意义肝细胞中ALT含量较多，且主要存在于肝细胞的可溶性部分。在肝脏受损时，ALT会释放入血，导致血中ALT活性浓度增加，因此测定ALT常作为判断肝细胞受损的灵敏指标，但其他的疾病或因素也可能引起ALT不同程度的增高。临床上常同时测定ALT和AST含量来诊断和鉴别诊断肝脏疾病及其病变程度,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,常见疾病ALT和AST及同工酶的变化,一、丙氨酸氨基转
12、移酶的测定,1.血清ALT活性增高（1）肝胆疾病 传染性肝炎、肝癌、中毒性肝炎、脂肪肝和胆管炎等（2）心血管疾病 心肌梗死、心肌炎、心力衰竭时肝淤血和脑出血等,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,1.血清ALT活性增高（3）药物和毒物 氯丙嗪、异烟肼、水杨酸制剂及乙醇、铅、汞或有机磷等引起ALT活性增高2.血清ALT活性降低 磷酸吡哆醛缺乏症,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,应用评价转氨酶能够反映肝细胞损害程度，是用于肝脏疾病时观察疗效、判断预后的重要指标之一。但ALT缺乏特异性，存在于多种组织，并且有多种原因能造成肝细胞膜通透性的改变，如：疲劳、饮酒、感冒
13、甚至情绪因素等。另外，ALT活性变化与肝脏病理组织改变并不完全一致，在严重肝损伤患者ALT并不升高。因此肝功能损害需要综合其他情况来判断,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,（二）检测方法检测原理连续检测法ALT可催化L-丙氨酸和-酮戊二酸生成L-丙氨酸。丙氨酸、NADH和H+在LDH作用下可转化出NAD+，连续监测在340nm处NADH的吸光度下降速度来计算酶活性，该法属于酶偶联法，反应式如下,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,方法学评价IFCC推荐方法将原法测定温度从30改为37，将-酮戊二酸的用量从改良赖氏法的2mmol/L改为15mmol/L，以足了最
14、大反应速度对-酮戊二酸的用量要求，扩大了测定范围，提高了测定准确性。并对试剂组成做了详细的规定LDH应用兔肌来源的干粉制剂，不能选用硫酸铵悬浮液可加入叠氮钠和白蛋白来保持其活性酶制剂和清蛋白中应没有ALT和GLDH的污染,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,该法的缺陷是存在GLDH和内源性丙酮酸的干扰，但采用双试剂及底物启动的模式，和（或）延长延滞期可消除部分干扰。为了进一步减少干扰，测定过程中还要用无氨蒸馏水和不含杂酶的高纯度的试剂,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,另外，IFCC推荐法建议试剂中添加5-磷酸砒哆醛，其目的是使脱辅基的酶恢复酶活性，提高结果的
15、准确性，特别是部分肿瘤化疗病人和肾病病人会出现脱辅基的酶,丙氨酸氨基转移酶的测定,一、丙氨酸氨基转移酶的测定,参考区间2013年，我国卫生部发布了关于ALT的行业标准，反应温度37，试剂中不含5-磷酸吡哆醛时，成年人参考区间为男性950U/L，女性740U/L,丙氨酸氨基转移酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据天冬氨酸氨基转移酶(AST)，也称谷草转氨酶（GOT），AST和ALT是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶。AST催化天门冬氨酸和a-酮戊二酸的氨基转移作用，形成谷氨酸和草酰乙酸,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,
16、AST广泛分布于全身各组织，尤其以骨骼肌、心脏、肝脏和肾脏中最为丰富，在细胞内定位于线粒体（m-AST）和胞质（c-AST）中，同ALT，但约70%为m-AST。当这些组织细胞损伤或坏死时，由于细胞膜通透性增加，胞浆内的AST释放入血，致使血清中的AST活性升高,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,临床意义 AST在心肌细胞内含量较多，当心肌梗死时，血清中AST活力增高，在发病后612h之内显著增高，在48h达到高峰，约在35天恢复正常。血清中AST也可来源于肝细胞，各种肝病可引起血清AST的升高，有时可达1200U/L,中毒性肝炎还可更高 肌炎、胸膜炎、肾
17、炎及肺炎等也可引起血清AST的轻度增高,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,应用评价在临床上血清AST主要用于诊断急性心肌梗死（acute myocardial infarction AMI），也是肝炎患者的观察指标，AST/ALT比值对于判断肝炎的转归特别有价值,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,（二）检测方法检测原理连续检测法AST可催化L-天冬氨酸和-酮戊二酸生成草酰乙酸，草酰乙酸、NADH和H+在苹果酸脱氢酶（malic dehydrogenase，MD）作用下产生NAD+，连续监测在340 nm处NADH的吸光
18、度下降速度来计算酶活性。该方法属于酶偶联法，其反应式如下,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,方法学评价与ALT基本相同，IFCC推荐法用MD作指示酶。由于产物草酰乙酸不稳定，易转变为丙酮酸，故在试剂中加入LDH，实质是两个指示酶，但通常将LDH作为辅助酶，该法预孵育期较长，达90 s，目的是在预孵育期间将内源性的丙酮酸转化为乳酸，从而减少内源性丙酮酸的干扰,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,二、天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,参考区间酶活性测定温度37，底物中不加5-磷酸吡哆醛时成年人参考区间为840U/L,天冬氨酸氨基转移酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰
19、转肽酶及同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据-谷氨酰基转移酶(GGT)又称-谷氨酰转肽酶（-GTP或GGTP）是一种含巯基的线粒体酶，参与体内谷胱甘肽的代谢,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰基转移酶及其同工酶的测定,肾脏、肝脏和胰腺中GGT含量丰富，但血清中GGT主要来自肝胆系统。GGT在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统，因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中GGT增高,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化肾脏疾病 人体器官中GGT含量以肾脏最高，其次是前列腺、胰腺、肝脏、盲肠和大脑。在肾脏、胰腺和肝脏中，GGT
20、的含量比为100：8：4。肾脏中的GGT含量虽高，但在肾脏疾病时，血液中的GGT活性升高却不明显。测定尿中GGT活性有助于诊断肾小管疾病,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化肝脏疾病 血清GGT主要用于诊断肝胆疾病。原发性肝癌、胰腺癌和乏特壶腹癌时，血清GGT活性显著升高，特别是在诊断恶性肿瘤患者有无肝转移和肝癌术后有无复发时，阳性率可达90%。GGT同工酶与AFP联合检测可使原发性肝癌AFP检测的阳性率明显提高,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,临床意义病理性变化其他 嗜酒或长期服用某些药物如苯巴比妥、苯妥英钠、安替
21、比林时，血清中GGT活性也会升高。口服避孕药会使GGT值增高20%,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,常见疾病GGT活性的变化,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,应用评价血清GGT主要用于诊断肝胆疾病，GGT同工酶与AFP联合检测可使原发性肝癌AFP检测的阳性率明显提高GGT是一种底物特异性不高的酶，能作用于一系列含谷氨酰基的化合物，其生理功能尚不十分清楚,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,（二）检测方法检测原理以色素原GCNA为底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化-谷氨酰基团从GCNA转移到甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基-5-氨基
22、苯甲酸。2-硝基-5-氨基苯甲酸的生成量与样品中的GGT活性成正比关系，因此，测定405 nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。其反应式如下,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,方法学评价GCNA第3位上含有亲水基团羰基，溶解度增加，且底物稳定性较好，自身水解作用小。需要注意的是原IFCC推荐方法的测定pH为8.20，反应温度30，若反应温度37时最适pH则为7.70，并要以甘氨酰甘氨酸和氢氧化钠做缓冲体系，甘氨酰甘氨酸既是缓冲液又可看成是底物，与甘氨酸或甘氨三肽为受体相比，酶促反应速度可以提高5倍,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,
23、方法学评价GCNA第3位上含有亲水基团羰基，溶解度增加，且底物稳定性较好，自身水解作用小。需要注意的是2-硝基-5-氨基苯甲酸在410 nm处的摩尔消光系数（）为7.96103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择401 nm或405 nm时需注意校正由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积分数0.0909，为了样品和反应液在37平衡，故需要孵育时间180s，并采用底物启动模式,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,三、-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,参考区间成年男性GGT 1150U/L（37）成年女性GGT 732U/L（37）,-谷氨酰转肽酶及同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的
24、测定,（一）检验项目项目检测依据肌酸激酶(CK)能催化高能磷酸键在肌酸和ATP之间转换，生成磷酸肌酸和ADP的可逆反应。磷酸肌酸的高能磷酸键是肌肉收缩时能量的直接来源,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据CK主要分布在脑组织和各种肌肉组织中，CK为二聚体结构，由M和B两个亚基构成，可组成三种同工酶，即CK-MM、CK-MB和CK-BB。CK-MM主要存在于骨骼肌中，平滑肌以CK-BB含量相对较高，CK-BB在脑中的含量明显高于其他组织，心肌是CK-MB含量丰富的唯一器官。当这些组织器官受损伤时，血清中CK的含量升高,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌
25、酸激酶及其同工酶的测定,临床意义血清CK主要用于心肌梗死的诊断。心肌梗死发生后48h，CK开始升高，1248h达最高峰，可达正常上限的1012倍，在24d降至正常水平。CK对诊断心肌梗死较AST、LDH的阳性率高，特异性强，是用于心肌梗死早期诊断的一项较好的指标，同时对估计病情和判断预后也有一定的参考价值。但在测定时可受样品溶血情况的影响。CK-MB是目前公认的诊断AMI较有价值的生化指标病毒性心肌炎时，CK也会升高,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,临床意义皮肌炎、肌营养不良、骨骼肌损伤等也会使CK升高脑膜炎、脑血管意外、甲状腺功能低下等疾病及一些非疾病因素如剧烈运动、
26、肌肉注射氯丙嗪和抗生素、各种插管及手术也可引起CK活性增高甲亢，长期卧床者总CK（主要为CK-MM）可下降,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,常见疾病的血清CK及同工酶变化,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,常见疾病的血清CK及同工酶变化,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,应用评价临床可以从血液、脑脊液以及羊水等体液中检测到CK及其同工酶活性，CK及其同工酶活性测定主要用于AMI目前CK-MB的测定，临床使用的免疫抑制-酶动力学法不特异，CK-BB、巨CK、线粒体CK以及某些CK的变异体都不会被M亚基的抗体封闭，这些均导致CK-MB结果偏高。此外 AMI诊断时应注意CK与CK-M
27、B的时效性。AMI发病8h内查CK不高，不可轻易排除诊断，应继续动态观察,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,（二）检测方法检测原理 酶偶联法以N-乙酰半胱氨酸（N-acetvl cvsteine，NAC）为激活剂，偶联己糖激酶(HK)，以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P-D）作指示酶，连续监测NADPH在340 nm处的吸光度上升速率来计算酶活性。反应式如下,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,肌酸激酶及其同工酶的测定,（二）检测方法检测原理 酶偶联法,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,
28、方法学评价酶偶联连续监测法反应速度快，不需做血清空白对照，故在临床使用广泛。该法测定中的影响因素如下巯基激活物CK是巯基酶，常用NAC、谷胱甘肽和巯基乙醇做激活剂，但应注意试剂纯度。同时用乙二胺四乙酸(EDTA)络合Ca2+，防止NAC由二价离子催化发生的氧化，从而增加反应混合物的稳定性,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,方法学评价酶偶联连续监测法反应速度快，不需做血清空白对照，故在临床使用广泛。该法测定中的影响因素如下虽然红细胞中不含CK，但含有大量腺苷酸激酶（adenvlatekinase，AK），因此溶血可使CK活性假性增高。为消除其干扰必须使用AK抑制剂，以5腺嘌
29、呤核苷酸（adenosine 5monophosphate，AMP）和二腺苷-5-磷酸p，p-di（adenosine5）pentaphosphate，AP5A联用效果最好。若试剂中未加入AMP和AP5A，溶血标本将产生明显干扰,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,方法学评价酶偶联连续监测法反应速度快，不需做血清空白对照，故在临床使用广泛。该法测定中的影响因素如下在反应开始时，反应速率呈现一个缓慢上升的延滞期，一般来讲为25 110 s、30 90 s和37 60 s，测定中应注意，避免造成结果不准确该法的线性上限为3000 ULN，高于此值的样品需要用150 mmol/L
30、的氯化钠溶液稀释后再测定。由于稀释后的血清中AK抑制剂也被稀释，因此测定结果比原结果偏高,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、肌酸激酶及其同工酶的测定,参考区间成年男性 38174U/L成年女性 26140U/L,肌酸激酶及其同工酶的测定,四、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据乳酸脱氢酶(LD或LDH)是临床应用较多的一种脱氢酶，属于氧化还原酶类。LDH是参与糖无氧酵解和糖异生的重要酶。它催化乳酸氧化成丙酮酸，NAD为受氢体；或催化丙酮酸还原成乳酸，NADH为供氢体,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据乳酸脱氢酶(LD)存在于所有
31、体细胞的胞质中，以骨骼肌、肾和心肌中含量最为丰富。LD是由M和H两个亚基组成的四聚体，共形成5种结构不同的同工酶。按电泳时的泳动速度，分别命名为LD1（H4），LD2（H3M），LD3（H2M2），LD4（HM3）和LD5（M4）,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据LD1主要分布在心肌，占总LD1活性的50%以上（正常时血浆LD2高于LD1），LD1也存在于红细胞中，且活性为心肌LD1的100倍；LD5主要分布在横纹肌和肝脏；LD3主要存在于脾、肺。当这些组织器官受损或病变时，可导致乳酸脱氢酶逸出，引起血清乳酸脱氢酶活力增加,乳酸脱氢酶及其同
32、工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,临床意义血清中LD活性增高主要见于心肌梗死、肝病、肺梗死、白血病、恶性肿瘤、恶性淋巴瘤等的诊断。同时，某些肿瘤转移后所致的胸腹水中LD活性往往也升高,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,常见疾病血清LD及同工酶的变化,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,应用评价由于LD几乎存在于所有体细胞中，而且在人体组织中的活性普遍很高，所以血清中LD升高对任何单一组织或器官都是非特异的。在急性心肌梗死时升高迟、达到高峰晚，故对早期诊断价值不大。由于半寿期长（10163h）多用于回顾性诊断。LD同工酶的组织分布相对集中，但某些组织器官可存在一种
33、或多种同工酶，一种同工酶的升高可能会不同程度的引起其他同工酶水平的变化,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,检测原理连续检测法 LD活性的测定方法有两种根据从乳酸氧化成丙酮酸的正向反应（LP），乳酸和NAD作为酶底物，在340nm波长监测吸光度上升速率,称LD-L法根据丙酮酸还原成乳酸的逆向反应（PL），丙酮酸和NADH作为酶底物，在340nm波长监测吸光度下降速率，称LD-P法,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,340nm波长吸光度上升或下降速率与标本中LD活性成正比关系。其中正向反应连续检测法是IFCC和我国检验学会的推荐方法。反应式如下
34、LP PL,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,方法学评价正向反应法优点 底物乳酸和NAD+比逆向反应所用的NADH和丙酮酸稳定；NAD+较NADH含抑制LD的杂质少；乳酸对LD的抑制作用小于丙酮酸；线性范围较宽，重复性好于逆向反应；底物抑制作用小，线性反应持续时间较长缺点 需要的底物浓度较高，反应速度较慢,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,方法学评价逆向反应法优点 NADH用量少，试剂成本低，反应速率快，灵敏度高缺点 NADH和丙酮酸的稳定性差；过量丙酮酸对LD的抑制作用较大。NADH种类、纯度和来源不同，对酶反应速度有明显的影响。该方法以丙
35、酮酸为底物，氨羧基甲酸是LD的竞争性抑制剂，草酸盐是非竞争性抑制剂，高浓度的尿素能使LD分子解聚或破坏酶蛋白二级或三级结构，使酶完全失活，低浓度的尿素是LD的竞争性抑制剂,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,不同的LD同工酶对冷冻的敏感性不一样，LD4和LD5对冷冻很敏感。如果血清放置在-20过夜，LD4和LD5活性将全部丧失。所以，血清标本应保持在室温，如果要长期保存，应加NAD+(10 mg/mL_)或谷胱甘肽(3.1 mg/mL_)后保存在4，可以减缓LD4和LD5的失活,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,五、乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,参考区间LD-L法 成年人 10
36、9245U/L LD-P法 成年人 200380U/L,乳酸脱氢酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据碱性磷酸酶（ALP）属磷酸单酯水解酶，是一组特异的磷酸酯酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5-P末端转换成5-OH末端,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据ALP不是单一的酶，而是一组同工酶。ALP同工酶分为四型生殖细胞型（GCAP）、胎盘型（PALP）、肠型（IAP）和非特异组织型（TUAP）非特异组织型是在酶蛋白合成后，经过不同形式的修饰和加工，形成的肝型、胆型、肾型、
37、骨骼型等酶的多种形式。在病理条件下还可能出现高分子ALP，以及一些和肿瘤有关的变异ALP,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据ALP几乎存在于机体的各个组织，但以骨骼、牙齿、肝脏、肾脏含量较多。正常人血清中的ALP主要来自骨骼，由成骨细胞产生。ALP经肝胆系统进行排泄，所以当肝胆系统疾病时，肝细胞合成ALP增加，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，返流入血从而引起血清ALP明显升高,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,临床意义肝脏疾病 阻塞性黄疸、肝硬化、肝坏死时，血清ALP活性明显升高，肝细胞性黄疸则
38、升高不明显。原发性和继发性肝癌时血清ALP活性明显升高，与癌组织中或癌肿周围肝细胞合成ALP增加有关。无黄疸的肝脏疾病患者血中发现有血清ALP活性升高，应警惕有无肝癌的可能肿瘤 如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨细胞瘤、骨肉瘤等，血清ALP活性增高时，提示可能有肝脏转移,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,临床意义其他疾病 变形性骨炎、成骨细胞癌、佝偻病、骨软化、甲状腺及甲状旁腺功能亢进、遗传性磷酸酶过多症时，血清ALP活性明显升高 药物 很多药物也可使血清ALP增高，如巴比妥类、抗生素（红霉素、庆大霉素、氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等）,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷
39、酸酶及其同工酶的测定,常见疾病血清ALP活性变化,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,血清ALP活性减低 较少见，主要见于呆小症、磷酸酶过少症、维生素C缺乏症。慢性肾炎、乳糜泻、恶性贫血、恶病质、甲状腺功能不全或减退、营养不良等均可引起ALP活性减低,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,应用评价临床上检测血清ALP是肝胆系统疾病诊断和鉴别诊断指标之一，尤其是黄疸的鉴别诊断，但由于骨组织中ALP很活跃，因此当血清ALP增高时应加以鉴别,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,（二）检测方法检测原理连续检测法在以2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)为缓冲液
40、的碱性溶液中，ALP能催化无色的4-NPP分解出磷酸基团，生成游离的对硝基苯酚(4-NP或PNP)，4-NP在碱性溶液中转变成醌式结构，呈现较深的黄色，在波长405 nm处连续监测吸光度增高速率，计算ALP活性。其反应式如下,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定5,方法学评价IFCC推荐法AMP作为缓冲液，AMP和二乙醇胺（DEA，日本推荐使用）都是激活型缓冲液，作为酶的底物参与磷酸酰基的转移，因此能增进酶促反应的速率，所测的的ALP活性要比用碳酸盐缓冲液高26倍。而DEA的激活作用比AMP更强。因此使用不同缓冲液的方法测的ALP活性参考区间不同。还有一种基于IFCC的方
41、法，使用活性缓冲液N-甲基-D-葡萄糖胺(n-methyl-d-glucamine，MEG)，将底物加入到反应混合物中即可引发酶促反应,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,临床检测时需注意溶血标本ALP酶活力会下降，凡可络合ALP的抗凝剂（如乙二胺四乙酸二钾盐即EDTA-K2）均可抑制酶活性温度可影响测定结果，室温及冰箱贮存血清均可使酶活性升高，14日可使酶活性增高3%6%；冰冻血清酶活性降低，复温后则恢复。因此，采集的标本最好及时测定,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,临床检测时需注意不同饮食对ALP测定有一定影响，如高脂饮食可使小肠合成AL
42、P增高，高糖饮食也可使酶活力升高，高蛋白饮食则使酶活力降低用作检测摩尔吸光系数的标准品对硝基苯酚和底物磷酸对硝基苯酚必须达检测要求,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,六、碱性磷酸酶及其同工酶的测定,参考区间女性112岁500U/L 15岁，40150U/L男性112岁500U/L 1215岁750U/L25岁，40150U/L,碱性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据酸性磷酸酶（ACP）是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶。其作用类似ALP的磷酸酶，不同点是作用的最适pH偏酸，为4.57.0,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及
43、其同工酶的测定,ACP几乎存在于体内所有细胞中，主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内其中以前列腺含量最多。正常男性血液中ACP约1/31/2来自前列腺，女性血中ACP可能来自血小板或破骨细胞。ACP同工酶分为前列腺ACP（prostate acid phosphatase，PAP）和非前列腺ACP（如红细胞ACP、溶酶体ACP等）两大类。当组织细胞受损时，ACP释放入血增加,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及其同工酶的测定,临床意义临床上血清ACP活性测定主要是作为前列腺癌的辅助诊断、疗效观察及预后判断的指标。前列腺癌，特别是存在转移时，血清ACP明显增高，前列腺ACP更有诊断意义。溶
44、血性疾病、急性尿潴留、变形性骨炎或者近期做过直肠检查者，ACP也可轻度升高,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及其同工酶的测定,应用评价血清中ACP的测定主要用于前列腺癌的辅助诊断及疗效观察指标，由于血清中ACP活性极不稳定，其活性测定的应用较少。由于ACP几乎存在于体内所以细胞中，为了鉴别血清中增加的酸性磷酸酶是来自前列腺还是来自其他器官，必须加以区别。为此可进一步采用某些抑制剂进行选择性抑制作用。例如：乙醇和酒石酸对前列腺酸性磷酸酶有显著的抑制作用，而对红血球酸性磷酸酶的抑制作用较弱,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及其同工酶的测定,（二）检测方法检测原理 连续检测法AC
45、P催化-萘基磷酸盐，在pH 4.56.0的条件下释放无机磷酸盐。产物-萘酚则偶联有色的偶氮试剂（如固红TR盐），通过在405 nm处监测偶氮化合物生成的速率来测定ACP的活性。其反应式为,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸性磷酸酶及其同工酶的测定,方法学评价Badson氏改良法属于连续监测法，但是需要两步才能完成。-萘酚与重氮盐的反应在很短的时间内就能完成，显色的速度仅受-萘酚产生的速率限制。ACP性质极不稳定，血清室温下放置2.5h ACP活力即可下降10%左右。每毫升血清中加入20L 5mmol/L的醋酸缓冲液（pH 5.0）做稳定剂，在4可稳定3天左右,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,七、酸
46、性磷酸酶及其同工酶的测定,参考区间成人总酶活性为09U/L，前列腺酸性磷酸酶为03U/L（连续监测法）,酸性磷酸酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,（一）检验项目项目检测依据-淀粉酶（AMY或AMS）即-1,4-D-葡糖4-葡聚糖水解酶，属于糖苷链水解酶，作用于-1,4糖苷键，是一种钙依赖性金属蛋白酶，卤素和其他阴离子对其有激活作。,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,AMY主要存在于胰腺和唾液腺中。AMY有两种同工酶，即唾液型（S-AMY）和胰腺型（P-AMY）。正常人血清中AMY主要由肝脏产生，当肝脏受损时，AMY释放增加。另外淀粉酶相对分子量小，可从肾小球滤过
47、出现在尿液中。淀粉酶是唯一能在正常时出现于尿液中的血清酶,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,有时淀粉酶与抗淀粉酶自身抗体形成高分子复合物，形成巨淀粉酶，则不能从肾小球滤过。肾功能严重障碍时，血清AMY也可升高，而尿AMY降低,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,临床意义AMY主要由唾液腺和胰腺分泌，可通过肾小球滤过。流行性腮腺炎，特别是急性胰腺炎时，血和尿中的AMY显著升高。急性胰腺炎发病后2h血清AMY开始升高，1224h达到高峰，25d下降至正常。若碘淀粉比色法结果超过500ULN有意义，达350ULN时应怀疑此病。而尿AMY约于发病后1224h开始升高，
48、下降也比血清AMY慢。因此，在急性胰腺炎后期测定尿AMY更有价值,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,临床意义急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、溃疡病穿孔及吗啡注射后等均可引起血清AMY增高，但一般低于500ULN正常人血清中AMY主要由肝脏产生，因此血清与尿中AMY同时减低主要见于肝炎、肝硬化、肝癌及急性和慢性胆囊炎等。肾功能严重障碍时，血清AMY升高，但尿AMY降低,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,应用评价临床上可以从血液、尿液以及唾液等体液中检测淀粉酶的活性。血清淀粉酶和尿淀粉酶测定是胰腺疾病最常用的实验室诊断方法血清中淀粉酶主要来自胰腺、唾液腺；尿
49、液中淀粉酶 则来自于血液。尿淀粉酶水平波动较大，所以用血清淀粉酶检测为好,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,（二）检测方法检测原理以对硝基酚麦芽七糖苷（4-NP-G7）为底物，经-淀粉酶催化水解为游离的寡糖（G5，G4，G3）及葡萄糖残基减少的对硝基酚寡糖苷（4-NP-G2、4NP-G3和4-NP-G4）。后者在-葡萄糖苷酶催化下，进一步水解为葡萄糖和对硝基酚（其摩尔数仅为酶解底物4-NP-G7的1/3，其余2/3还结合在4-NP-G4中）。对硝基酚的生成量在一定范围内与-淀粉酶活性成正比。其反应式为,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,淀粉酶及其同工酶的测定
50、,八、淀粉酶及其同工酶的测定,方法学评价-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，若将PNP-G7的非还原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，可以阻止-葡萄糖苷酶对底物的水解作用，使底物的稳定性提高59倍。另外，多功能-葡萄糖苷酶对EPS的所有降解产物（PNP-G1PNP-G5）都有相同的转换率，从而使底物中的所有PNP被回收，可以直接用PNP的摩尔吸光系数计算酶活性,淀粉酶及其同工酶的测定,八、淀粉酶及其同工酶的测定,方法学评价以2-氯对硝基酚麦芽三糖苷(CNP-G3)为底物的方法，被淀粉酶水解释放出产物4-氯对硝基苯酚CNP)。淀粉酶水解CNP-G3的速度是G3的10倍，因而不需要用辅助酶，直接水解产
