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1、肿瘤的发生,肿瘤的分类,1976年，J.M.Bishop和H.E.Varmus发现宿主细胞基因组内含有与鸟类Rous肉瘤病毒高度同源的src 基因，并首次提出细胞癌基因（cellular oncogene,c-onc），从而分享了1989年的诺贝尔生理医学奖。,Harold E.Varmus,J Michael Bishop,历史,信号通路（signal pathway）的提出最早可以追溯到1972年，不过那时被称为信号转换（signal transmission）。1980年，M.Rodbell在一篇综述中提到信号转导（signal transduction），此后这个概念就被广泛使用了。,
2、细胞信号转导的基本过程,信号分子,接收器,信号转导分子,靶细胞效应,慢反应激活转录因子调控靶基因表达,快反应调节效应蛋白的活性（代谢酶、离子通道等）,信号分子(ligand),化学信号：激素、神经递质和神经肽、局部体液因子、细胞的代谢物、外源性的药物或毒物物理信号：光、电、机械刺激、细胞之间和细胞与细胞外基质间的直接接触气体信号：NO、CO脂溶性:类固醇激素，甲状腺激素水溶性：生长因子等肽类激素,接收器(receiver),受体(receptor)细胞膜上或细胞内能识别生物活性分子并与之结合的成分，它能把识别和接受的信号正确无误地放大并传递到细胞内部，进而引起生物学效应能接受信号的其它成分,本
3、世纪初“受体”概念-1955年正式确立,1951年 发现NGF 1960年 发现EGF 1986年 诺贝尔生理与医学奖1957年 第二信使cAMP发现并提出 1971年 诺贝尔生理与医学奖1957年 蛋白磷酸化的发现及分离 1992年 诺贝尔生理与医学奖20世纪70年代 G蛋白发现和克隆 1994年 诺贝尔生理与医学奖20世纪90年代 细胞信号转导的网络研究初见雏形并日趋完善NO伟哥1997年美国信息研究所“热点科学研究”论文统计：科研项目排行第一,(一)受体,膜受体(membrane receptor)存在于细胞膜上能与胞外信息分子结合，并将信号传递至胞浆或核内，调节靶细胞功能的分子核受体(
4、nuclear receptor)位于胞浆或核内的受体，激活后作为转录因子，在核内调节靶基因的转录活性，从而诱发细胞特定的应答反应,膜受体,G蛋白偶联受体受体酪氨酸激酶家族细胞因子受体超家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶型受体家族死亡受体家族离子通道型受体粘附分子受体,，,核受体,甾体激素受体超家族非甾体激素受体超家族 甲状腺激素受体维甲酸受体维生素D3受体家族,(二)能接受信号的其它成分,粘附分子（如钙粘素、整合素）离子通道免疫球蛋白选择素,概念,信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路。这些细胞外的分子信号（称为配体，ligand）包括激素、生长因子、细胞因子
5、、神经递质以及其它小分子化合物等。当配体特异性地结合到细胞膜或细胞内的受体（receptor）后，在细胞内的信号传递。,特点1.蛋白磷酸化,各个信号通路中上游蛋白对下游蛋白活性的调节（包括激活或抑制作用）主要是通过添加或去除磷酸基团，从而改变下游蛋白的立体构象完成的。所以，构成信号通路的主要成员是蛋白激酶和磷酸酶，它们能够快速改变和恢复下游蛋白的构象。,1992年诺贝尔生理或医学奖授予给了Edmond Fischer 和 Edwin Krebsfor their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a bio
6、logical regulatory mechanism,特点2.级联放大,从细胞受体接收外界信号到最后做出综合性应答，不仅是一个信号转导过程，更重要的是将外界信号进行逐步放大的过程。受体蛋白将细胞外信号转变为细胞内信号，经信号级联放大、分散和调节，最终产生一系列综合性的细胞应答，包括下游基因表达的调节、细胞内酶活性的变化、细胞骨架构型和DNA合成的改变等,信号放大的定义,信号转导过程所产生的最终靶物质的浓度远远高于输入信号所能达致水平的现象。这是由于输入的信号通过信号转导级联反应被逐级放大，并生成对靶物质的产生起作用的酶或效应物所造成的结果。常见于G蛋白介导的信号通路。信号的过度放大可能非常
7、有害，因此细胞通过抑制性受体或诱饵受体等对其进行控制。,信号转导与细胞应答模式,JAK-STAT5信号通路,JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体酪氨酸激酶JAK转录因子STAT。,酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor）,许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这包括白介素27（IL-2
8、7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）IFN（干扰素）等等。,共同点,这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。,酪氨酸激酶JAK（Janus kinase）,Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。,JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2
9、、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homologydomain,JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域,转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription）,STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。,STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区SH3结构域、SH2结构域C-端的转录激活区。其中，序列
10、上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”,细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（docking site），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录,3)JAK-STAT
11、信号通路与白血病,JAK-STAT信号通路功能广泛，目前许多研究都集中于免疫反应与免疫调控。结合最新一期癌细胞（Cancer Cell）杂志刊登有关STAT5信号与白血病JMML的关系，下面我们将着重介绍JAKSTAT信号通路与白血病的发病机制。,白血病是造血组织的恶性疾病，又称“血癌”，是我国最常见的恶性肿瘤之一。该病居年轻人所患恶性疾病中的首位。与正常的造血细胞相比，白血病细胞表现出截然相反的生物学特性。正常造血细胞在细胞因子的作用下不断分化成熟，而白血病细胞则表现为分化过程受阻，进而无限制地增殖，这提示细胞内信号通路的异常在白血病形成中起着重要的作用。,在白血病细胞中普遍存在着JAK-S
12、TAT信号通路的持续激活，因此，STAT蛋白也就成为重点检测的指标之一。STAT分子的过量表达往往出现在很多恶性增殖性疾病中，而造血系统的肿瘤（包括白血病和淋巴瘤）中STAT家族被活化的种类最多，例如STAT1、STAT3和STAT5就是白血病中最常见的持续激活的信号蛋白。,我们已经在人体白血病细胞中发现了很多JAK 基因的点突变，其中的一些点突变造成激酶JAK持续激活STAT蛋白。最典型的例子就是JAK2V617F突变（蛋白JAK2第617位的缬氨酸突变成苯丙氨酸）造成JAK-STAT信号通路的异常激活。,p53信号通路,p53 基因受多种信号因子的调控。例如：当细胞中的DNA损伤或细胞增殖
13、异常时，p53 基因被激活，导致细胞周期停滞并启动DNA修复机制，使损伤的DNA得以修复,酵母双杂交系统,将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域基因和GAL4激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。,双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DB)和转录激
14、活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。,MDM2是一种特异性针对p53的泛素化E3连接酶，它可直接与p53蛋白结合来促进p53蛋白的泛素化降解，并在细胞内p53蛋白动态平衡中发挥关键的作用。MDM2本身也可被p53蛋白激活，因此MDM2是p53通路中重要的负反馈调节因子（negative feedback regulator）,目前看来，在肿瘤形成的复杂网络和调控体系中，p53是最主要的因素。有人认为p53是很好的肿
15、瘤诊断标志物，可以作为癌症早期诊断的重要指标。认识到p53 基因的重要作用后，全世界数以千计的分子生物学家正在抛开原来的课题转而研究p53，希望以此作为攻克癌症的突破口。科学家相信，利用p53 基因发现并治疗癌症的前景非常广阔。除了基因治疗，研究人员正在筛选可以影响p53 基因上下游调控的小分子化合物。罗氏制药公司开发的一种名为nutlins的小分子化合物，能够干扰p53和MDM2之间的调控关系，有望成为一种有效的抗癌药物。,针对P53的治疗,其中美国Introgen Therapeutics公司曾经在1996年得到过非常好的临床实验结果。直到2004年，使用腺病毒载体治疗头颈部肿瘤的p53基
16、因疗法才在中国获得批准，这也是迄今为止第一个获批的能够常规用于人体临床治疗的基因治疗方法。但是我们仍然需要时间对这种疗法做出最终的抉择。众多的患者和科学家也都在热切期盼Introgen Therapeutics公司开发的新型腺病毒p53基因治疗产品Advexin的III期临床实验结果。,腺病毒载体,腺病毒载体转基因效率高，体外实验通常接近100的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；容易制得高滴度病毒载体，在细胞培养物中重组病毒滴度可达（10E11）/ml；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多
17、的应用，成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。,典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。pCA13表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失E1区及其他区域293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。pBHG11因为缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋
18、白，从而包装产生腺病毒颗粒。该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。,3 NF-B信号,1975年，E.A.Carswell和L.J.Old等人发现已接种卡介苗的小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中产生了一种可引起动物肿瘤组织出血坏死的物质，该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株都具有细胞杀伤作用，于是他们将这种物质命名为肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）。TNF是迄今发现的抗肿瘤效果最强的细胞因子。,TNF是一种糖蛋白，它以两种形式存在：TNF-和TNF-。TNF-由单核细胞和巨噬细胞产生，它可引起肿瘤组织出血坏死，而脂多糖Lipopolysaccharides,LPS）是较强的刺激剂。TNF-是一种淋巴因子，又称淋巴毒素（lymphotoxin,LT）。抗原或丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能。,人的TNF-基因长2.76 kb，由4个外显子和3个内含子组成，定位在第六号染色体上。人TNF-前体由233个氨基酸组成，含有76个氨基酸残基的信号肽切除信号肽后形成157个氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-。通过基因工程方法改造后的TNF-具有更好的生物学活性和抗肿瘤效果。,
