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1、1,第八章.免疫组化双重染色技术(Double staining technology in immunohistochemistry)用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两种以上的抗原,以发现其定位,形态和功能上的相互关系.I.连续切片双重染色法 A.最简单最可靠.用同样的免疫组化方法,在两张相邻切片上各自显示一种抗原,然后比较.不会互相干扰或出现假双标.B.切片厚度13m,否则不能确保双阳性结果.神经组织切片1020m,可采用“镜像”法 即相邻切片翻转后贴在载玻片上,软件PS处理.II.免疫荧光双重染色法:用不同的荧光色素标记不同的抗体,显示不同的颜色.,2,A.直接法:1.一步
2、法:将FITC(490552030nm,绿色荧光)和TRITC(550620nm,红色荧光)或其他荧光染料分别标记的两种一抗混合,使每个抗体均为最适稀释度,然后孵育切片.2.二步法:先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片.3.观察:同一个视野里.a.对每一种荧光标记物(绿色或红色)使用不同的滤色板进行观察和照相,每张照片显示一种荧光,比较两张照片.b.两种荧光重叠照相,则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞(呈绿色或红色).如果两种抗原存在于同一个细胞或结构,则呈现两种红绿荧光的混合色,如黄色.,3,Alexa Fluor 488-1st antibodies shows EEA1,Alexa
3、 Fluor 568-1st antibodies shows beta-tubulins.Cultured 18-embryonic day rat hippocampal neurons.,4,B.间接法:1.两种一抗不标记,但来自不同种属的动物如兔和豚鼠(Guinea pig).2.两种来源于同种动物或不同种动物的二抗(如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠IgG,或羊抗兔IgG和猪抗豚鼠IgG)分别以FITC和TRITC标记.,3.染色步骤:a.先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片,显示第一种抗原;然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片,显示第二种抗原.或者将两种一抗混合后孵育切片,再
4、将两种标记的二抗混合后孵育切片.b.其余同前.,5,COS7 cells,Y.W Lin.Nuclei were stained by Hoechst blue,USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594.Mixed color is yellow.,6,FITC-2nd anti-microtubules,TRITC-2nd anti-actins,DAPI shows nucleus in cultured Bovine pulmonary artery endothelial cells.,Tex
5、as Red-2nd anti-histone,Alexa Fluor 488-2nd anti-PMP70 in peroxisome,Alexa Fluor 350-phalloidin.Indian Muntjac deer skin fibroblast cell.,7,Alexa Fluor 568-2nd anti-giantin in G,Alexa Fluor 488-2nd anti-NPCP,Alexa Fluor 350-phalloidin.Tahr Ovary Epithelial Cells(HJ1.Ov Line).,Texas red-2nd anti-insu
6、lin,FITC-2nd anti glucagons in mouse pancreas.,8,III.免疫酶双重染色A.单酶法:常见于两种一抗来自同种属动物.1.原理:a.用一种酶如 HRP标记显示两种不同的抗原,但用不同的电子供体如DAB和CN呈现不同颜色的反应终产物.,b.两重染色之间需将第一次染色反应中的各级抗体和酶(步骤a)及其反应产物从组织上洗脱(步骤b).c.连续做两次染色,所费时间较长.,9,假性双标的来源第一次用ABC法染色,氧化法洗脱抗体.对照试验证实此为假性双标.1992.,10,2.抗体洗脱法:a.酸洗法:在pH2.2甘氨酸(Glycine)-HCl缓冲液中加入适量二
7、甲基甲酰胺(Dimethylfomamide,DMF),作用14小时使抗原-抗体复合物解离.b.氧化法:2.5%KMnO4:5%H2SO4:DDH2O=1:4:10260,1分,氧化除去抗体,0.5%偏重亚硫酸钠(Sodium Metabisulfite,Na2S2O5)漂白液脱色.第一次染色用CN显色,并注意对第二种抗原的影响(可设立对照).c.甲醛蒸气法:1升容器+3g多聚甲醛+切片,置80烤箱14小时,蒸汽破坏抗体的Ig结合部位.,11,3.步骤:a:第一次染色后,除去抗体和酶而使有色反应终产物留在抗原部位,再用同样方法进行第二次染色.*.切片处理,抑制内源性酶及NGS封闭同前.*.用P
8、AP法完成第一次染色,CN-H2O2显色.TBS洗.*.氧化法洗脱.TBS洗.*.用PAP法完成第二次染色,0.05%DAB-0.01%H2O2显色.TBS洗.甘油胶封片.,大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色)和生长激素细胞(棕色),免疫酶(PAP法)双重染色.1993.,12,b:第一次染色后,照相记录结果并记住照相视野的部位.用有机溶剂将反应终产物溶解除去,洗脱抗体复合物,然后进行第二次染色.对同一部位再一次照相,比较先后照相所得照片.*.切片处理同上.*.用PAP法完成第一次染色,CN-H2O2显色.TBS洗.*.TBS封片,照相(注意防止切片干燥).*.去盖片,TBS洗,再用酒精-二甲苯
9、-酒精处理,除去CN蓝色反应产物,DDH2O洗.*.氧化法洗脱,TBS洗.*.PAP法第2次染色,0.05%DAB-0.01%H2O2显色.TBS洗.*.甘油胶封片,找出第一次照相的部位,再次照相.,13,大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞(左,蓝色)与促性腺激素细胞(右,棕色)为同一种细胞,免疫酶(PAP法)双重染色.1993.,14,4.染色最佳条件的确定:先对两种待检抗原分别染色,以决定合适的抗体稀释度和反应条件等.5.双重染色先后次序的确定:先显示含量较少的抗原;先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原;先用不太敏感的抗体;先用DAB显色.6.对照试验:a.单染对照.b.在进行第二
10、次染色前,要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去,而且洗脱后对第二个待检抗原无影响.,15,B.双酶法:适用于两种一抗来源于不同种属动物,如兔和小鼠,或同种动物(如小鼠)的两种单克隆抗体,但其Ig亚类不同,如IgGl和IgG2a.1.原理:a.用两种无关的酶分别标记显示两种抗原,常用的酶为HRP和AKP,或HRP和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase).b.两重染色之间无需洗脱.c.两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠IgG,或抗小鼠IgGl和抗小鼠IgG2a.可以来自同种属动物或不同种属动物,可以是酶标抗体(一个用HRP,另一个用AKP标记),也可以是未标记抗体(一个用兔PAP,另
11、一个用小鼠APAAP).,16,d.可避免抗体残留而引起的假性双标记,不需洗脱.由于无交叉反应,可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先后显示两种酶的活性,在同一张切片上获得不同颜色的反应终产物,如棕色和蓝色.如两种抗原共存于同一个细胞,则出现灰紫色的混合色.,17,2.染色步骤:以先后使用PAP法和APAAP法为例.a.切片处理,抑制内源性酶及正常血清封闭如前.b.两种一抗混合液(各自稀释度由单染决定),室温30分或4过夜.TBS洗.c.两种二抗混合液(各自稀释度由单染决定),室温30分.TBS洗.d.PAP和APAAP混合液(各自稀释度由单染决定),室温30分.TBS洗.e.显示HRP,如
12、用0.05%DAB-0.01%H2O2,镜下控制染色.TBS洗.f.显示AKP,如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝BB或固红,镜下控制染色.TBS洗.g.甘油胶封片.,18,Anti-Esterase shows neuromyo junction in blue,Anti-P0 shows myelin in brown,silver staining shows axon in black.,19,SP法.AKP-Fast red and HRP-DAB shows P504S and p63,respectively.Prostate cancer.,20,3.染色的最佳条件:先对两种待检抗
13、原分别染色,以决定合适的抗体稀释度和反应条件等.4.双重染色的先后次序:先显示HRP,再显示AKP或葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase).5.对照试验:a.单染对照.b.必需排除两套抗体系统之间的交叉反应.如第二种羊抗兔IgG二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双标记,因此应事先做抗体进行交叉染色实验.,21,6.注意事项:a.厚切片(7m)可能出现混合色(双标记)的假象.b.APAAP法中缓冲液用TBS.c.内源性AKP一般不会引起问题.d.用两种二抗来源动物的NGS封闭.IV.免疫酶-免疫荧光双重染色法:首先用免疫酶法显示第一种抗原,然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原.若
14、两种一抗来自同一动物,注意可能发生的交叉反应.,22,V.免疫酶-免疫金(银)双重染色法 A.免疫酶-免疫金双重染色法:1.用PAP法显示第一种抗原,为了加强与胶体金的红色的对比可用CN显色,如该抗原存在于神经组织则用DAB显色.2.用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物,继之用IGS法显示第二种抗原,在光镜下监视染色,直到出现满意的红色为止.3.用PAP法后再用IGS法,可防止标记在二抗的胶体金颗粒与抗体一起洗脱掉.金标抗体穿透组织能力差,常需用较大的一抗和金标抗体浓度并提高其穿透力.,23,B.免疫酶-免疫金银双重染色法:1.用IGSS法显示第一种抗原,用5nm小颗粒胶体金标记二抗.应用物理显影液进行银加强后,在金颗粒周围形成金属银壳,不但增强了金颗粒的可见度,而且封闭了第一次染色的各级抗体,从而避免了第二次染色试剂发生交叉反应.因银壳可能覆盖第二种抗原,该法只适用于两种抗原存在于不同组织结构.2.缓冲液彻底清洗后,再用免疫酶法(如PAP或ABC法等)显示第二种抗原.IGSS法所得黑色可与免疫酶法所得棕色或蓝色等形成显明对比.,
