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1、实验八 PCR反应鉴定人类性别,一、实验目的了解有关PCR反应的原理及技术 要点。学习应用PCR反应进行性别鉴定的原理及方法。,二、PCR反应的原理,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，简称PCR）是一种在体外特异扩增位于两段已知序列之间DNA区段的核酸合成技术，是分子生物学研究领域的一项创举。该技术是由美国Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合发明的，主要贡献者为Mullis和Henery、Erlich。利用PCR可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，因此在分子
2、生物学、微生物学、医学及遗传学、法医判定和考古研究等领域得到广泛应用。,PCR主要由反复循环的变性、退火和延伸三个步骤构成：即在高温（95）下，使靶DNA双链受热变性成为两条单链；而后在低温（3755）下，两条寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72）下，以引物3端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新链。这样，经过一次循环目的DNA产物增加1倍。如此反复进行，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增。,PCR基本原理示意图,PCR反应体系的组成,模板 PCR可以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先需逆转录
3、成cDNA后才能进行PCR循环。模板DNA浓度对扩增有一定影响。,引物 PCR反应的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由引物限定的。引物长度至少应含有16个核苷酸，最好长达20-24个核苷酸。这种长度的引物在聚合反应温度下不会形成稳定二聚体。PCR反应中引物的终浓度通常为1mol/L.当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。,缓冲液 提供Taq DNA聚合酶最适酶促反应条件。常用的缓冲体系为50 Mm KCl，10 mMTris-HCl(pH8.3,RT)。另外还需要一定浓度的Mg2+，一般浓度为1.5mM。这是Ta
4、q DNA聚合酶活性所必需。另外它还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。,脱氧核苷三磷酸（dNTP）作为DNA合成的基本原料。dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合时的错误掺入，因此应当避免。一般在200mol/L浓度下使用。,耐热DNA聚合酶 目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热水生菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离提纯的天然酶和大肠杆菌合成的基因工程酶。在PCR反应中，每100l反应液中含1-2.5U T
5、aq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。,温度循环参数 变性温度与时间 通常选用95 30s。复性温度与时间 复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为55左右。延伸温度与时间 一般为72。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。循环数 循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。,三、利用PCR反应进行性别鉴定,原理 DYZ1位于Y染色体长臂的号卫星区域内，具有3.4kb的重复序列，拷贝数约5000，其特异序列的PCR
6、扩增可用于性别鉴定。扩增产物为154bp.,四、实验材料,DNA释放液：含有蛋白酶KPCR反应液：含有特异引物、dNTP混合 液和缓冲液。Taq酶液体石蜡无菌水,五、实验步骤,（一）、模板的制备 1.冷开水漱口后，用牙签刮取口腔黏膜细 胞。取80ul DNA释放液，牙签插入后，涡旋片刻。2.50水浴20分钟。3.弃牙签，石蜡油覆盖后离心片刻。94 处理10分钟。,（二）、加样及PCR扩增,1.PCR反应体系：总体积20 ulPCR反应液 15 ulDNA模板 5ul,2.设置对照：空白对照阴性对照阳性对照,（三）、扩增参数,预变性：94 5min变性：94 30s,退火：55 30s,重复35 cycles聚合：72 60s72 5min,（四）、电泳与结果判断,
