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1、1,2023/1/25,药物分析 Pharmaceutical Analysis,2,2023/1/25,第五章 体内药物分析,3,2023/1/25,第五章体内药物分析,4,2023/1/25,第五章,熟悉:体内样品的采集与制备方法 体内样品分析方法验证的技术要求,了解:体内药物分析的性质与意义,掌握:体内药物分析的特点和应用 体内样品分析的前处理 体内样品分析方法验证的内容,5,2023/1/25,体内药物分析,学习要求,体内药物分析的特点和应用 体内样品分析的前处理体内样品分析方法验证内容,体内药物分析的性质与意义,体内样品的 采集与制备方法体内样品分析方法 验证的技术要求,掌握,了解,
2、熟悉,6,2023/1/25,概述,体内药物分析,方法建立与验证,净化与浓集,原形,代谢物,体液或组织,色谱;免疫分析;生物 全面验证和部分验证,原形药物或其代谢物 缀合物,蛋白结合物,体内样品,存在形式,样品制备,分析方法,去蛋白;萃取;膜分离水解;化学衍生化,血液是主要样品尿液,唾液,头发和脏器,9,2023/1/25,体液,组织,排泄物,一、体内样品的种类,血液;唾液脑脊液;胃液;胆汁;乳汁;精液;泪液,尿液粪便;汗液,胃;肠;肝;肾;肺,脑;肌肉;头发,10,2023/1/25,常见体内样品,1.血样的采集 静脉,1-5ml 1/10 2.血浆的制备 抗凝剂,1000g离心 5-10m
3、in 淡黄色上清液 3.血清的制备 30min-1h 1000g离心 5-10min 上层淡黄色液体 4.全血的制备 抗凝剂,不离心,1.尿样的特点 原形,代谢物及缀合物 药物浓度较高 收集量大(15L)2.尿样的采集 自然排尿 规定时间段(6-8h)(时间尿)3.尿样的贮藏 加入适当防腐剂,TDM测定S代替P进行临床监测 1.唾液的组成 腮腺,舌下腺和颌下腺 2.唾液的采集 漱口15min,安静状态,自然流出的唾液 物理或化学方法刺激 3.样品的制备 3000r/min离心10min,上清液,1.样品的制备 制成水性基质匀浆溶液 2.样品的处理(1)沉淀蛋白法(2)酸/碱水解法(3)酶水解法
4、 蛋白水解酶中的枯草菌溶素,血样,尿样,唾液,组织,二、体内样品的采集与制备,50-60,20-40,11,2023/1/25,三、体内样品的贮存与处理,(一)冷藏与冷冻 短期保存:冰箱(4)冷藏 长期保存:冷柜(-20/-70-80)冷冻,小体积分装1.血浆/血清:分离(2h),硬质玻璃/聚乙烯管(EP),冷冻2.尿样:冷藏(2436h)加防腐剂3.唾液:冷冻保存时,解冻后充分搅匀后再用,(二)去活性 采样后立即终止酶的活性 常用方法:液氮速冻,微波照射,匀浆/沉淀,加酶活性阻断剂(氟化钠)或抗氧剂(VC),煮沸,12,2023/1/25,第二节体内样品分析的前处理,前处理(分离,浓集,改性
5、)为药物的测定提供条件 前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作,13,2023/1/25,仪器污染,劣化(去蛋白)提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化),血浆蛋白结合物;缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度,1.使待测组分游离,2.满足测定方法的要求,3.改善分析环境,一、体内样品前处理的目的,样品介质组成复杂:分离待测组分浓度低:浓集,前处理,14,2023/1/25,二、体内样品前处理的方法,去除蛋白质法,分离与浓集法,缀合物水解法,(一),(二),(三),化学衍生化法,(四),15,2023/1/25,(一)去除蛋白质法,加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出药物释放乙腈,
6、甲醇,丙酮,四氢呋喃等 血浆/血清与有机溶剂的体积比1(2-3),饱和硫酸铵,硫酸钠,硫酸镁,氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液的比12,10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清与强酸的比10.6上清液呈强酸性(pH4)酸性分解的药物不宜用,热变性蛋白质沉淀通常90方法简单只能除去热变性蛋白待测物热稳定性好,1.溶剂沉淀法,2.中性盐析法,3.强酸沉淀法,4.热凝固法,16,2023/1/25,(二)分离与浓集法,液相萃取法,固相萃取法,超滤法,1.,2.,3.,17,2023/1/25,1.液相萃取法,溶剂的选择原则,溶剂的用量,水相的pH,(1),(2),(3),提取操作,(4),18,2023/1/
7、25,(1)溶剂的选取原则,对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；沸点低,易挥发;与水不相混溶;无毒,不易燃烧;具有化学稳定和惰性;不影响紫外检测,*:含过氧化物；:肝脏毒性,有致癌作用,辅助试剂的使用 乙醚(1.2%水):氯化钠混合溶剂的使用 正己烷-异丙醇(95:5),19,2023/1/25,(2)溶剂的用量,有机相与水相(样品)体积比为1:15:1,碱性药物pH高于pKa 12单位酸性药物pH低于pKa 12单位碱性下提取,可减少内源性物质(酸性)的干扰碱性下不稳定,在中性用三氯甲烷和异丙醇提取,(3)水相的pH,提取1次若提取回收率较低(低于50%),提取23次脂溶性干扰物,可进
8、行小体积水溶液反提取,(4)提取操作,20,2023/1/25,2.固相萃取法,固相萃取法的原理,固相萃取法操作步骤,注意事项,(1),(2),(3),固相萃取法的特点,(4),自动化固相萃取,(5),21,2023/1/25,(1)固相萃取法的原理,含药物体内样品通过小柱时,受到“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)洗脱方式有两种:冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;药物直接被洗脱,干扰物保留,22,2023/1/25,(2)固相萃取法操作步骤,第1步:甲醇润湿小柱,活化填料;净化填料 第2步:水/缓冲液冲洗小柱,去除
9、甲醇;甲醇含量 过低(低于5%)致C18链弯曲折叠,回收率降低 第3步:加样,使样品通过小柱,并弃去滤过液 第4步:水/缓冲液冲洗 小柱,去除内源性及其 它干扰物质第5步:洗脱溶剂洗脱 待测物,收集洗脱液,平衡,23,2023/1/25,(3)注意事项,样品(血浆)通过萃取柱的流速在 1-2ml/min;冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失/选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂;萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸,有机胺,氨水,醋酸铵或离子对试剂,24,2023/1/25,(4)固相萃取法的特点,25,2023/1/25,(5)自动化固相萃取法,对于单个样品处理,SPE操作省时对于大
10、量样品的处理半自动SPE:萃取过程机械化全自动化仪器:通过柱切换技术 实现固相萃取与HPLC联用,26,2023/1/25,柱切换:固相萃取-LC/MS/MS,(5)自动化固相萃取法,27,2023/1/25,3.超滤法,ultrafiltration是一种膜分离技术按照截留分子量,选择半透膜,可分离30 1000kD的可溶性生物大分子无化学试剂,无相变化,提取操作,(4),简便,游离药物分析的首选方法;尤其适合TDM,28,2023/1/25,(三)缀合物水解法,简便,快速 水解过程中发生药物分解 专一性较差,葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶 专属性强 时间较长 可引入粘蛋白,溶剂萃取过程中缀合
11、物(尤其硫酸酯)直接分解,测定尿药总量,水解缀合物 趋向于直接测定缀合物,1.酸水解法,2.酶水解法,3.溶剂解法,29,2023/1/25,(四)化学衍生化法,1.在GC中的应用(1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)酰化:三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不对称衍生化:(S)-N-三氟 乙酰脯氨酰氯(ST-FPC),2.在HPLC中的应用(1)衍生化的分类 柱前/柱后;在线/离线(2)衍生化方法(1)紫外衍生化(2)荧光衍生化(3)非对映体衍生化,GC:提高药物的挥发性;增加药物的 稳定性;生成非对映异构体 HPLC:提高检测灵敏度;改善色谱分离,容量分析法
12、,30,2023/1/25,第三节体内样品分析方法与方法验证,分析方法的建立,一、,分析方法的验证,二、,31,2023/1/25,一、分析方法的建立,分析方法的选择,分析方法建立的一般程序,(一),(二),32,2023/1/25,(一)分析方法的选择,HPLC,GC HPLC-MSn,GC-MS,RIA,EIA,FIA;适用于大分子 TDM应用较多,抗生素生物利用度,等效性,TDM 应用较少,常用的检测方法:色谱分析法,免疫分析法和生物学方法,33,2023/1/25,(二)分析方法建立的一般程序,待测物,内标(必要时)的标准物质 色谱柱(填料),流动相,溶剂,进样量,试剂/溶剂试验;生物
13、介质试验 质控样品试验,代谢产物对待测物,内标物的干扰 配伍用药的干扰,分析方法的建立和验证过程系同步进行 为便于讨论,以色谱分析法为例分别叙述,1.色谱条件 的筛选,2.色谱条件 的优化,3.实际样品 的测试,34,2023/1/25,二、分析方法的验证,特异性,标准曲线与定量范围,定量下限,(一),(二),(三),精密度与准确度,(四),样品稳定性,(五),提取回收率,(六),方法,35,2023/1/25,二、分析方法的验证,分析过程的质量控制,未知样品浓度超限的处理,药用内源性物质的测定,(七),(八),(九),微生物/免疫学方法的验证,(十),名词解释,(十一),分析,其他,36,2
14、023/1/25,(一)特异性,比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品 软电离质谱(LC-MS)介质效应,比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际样品 必要时LC-DAD/MS确证峰的单一/同一,比较待测药物,同服药物,待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品,特异性(specificity),又称专属性或专一性,通常与选择性(selectivity)互用,1.内源性物质,2.未知代谢物,3.伍用药物,4.参比方法,参比方法横坐标(x),拟定方法纵坐标(y),最小二乘 y=a+bx a恒定干扰 b比例干扰(如,标记抗原不纯,交叉免疫),37,2023/1/25,(二)标准曲线
15、与定量范围,1.标准曲线的建立,(二),少数方法(如,IA)外,通常为线性模式 线性回归:最小二乘法或加权最小二乘法 自变量(x)为药物浓度,因变量(y)为响应信号强度,(1)系列标准溶液:n6(不包括0点);等比系列(23);通常为1001000倍(2)内标溶液:浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度(3)系列标准样品:空白生物介质,加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制:药物浓度,以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示,38,2023/1/25,(二)标准曲线与定量范围,2.限度要求,通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点定量范围覆盖
16、全部待测样品浓度范围定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%5%(1/101/20)标准曲线各浓度点的回归计算值(x)与标示值(x)之间的偏差bias=(x-x)/x100%在可接受的范围之内最低浓度点的偏差在20%以内其余浓度点的偏差在15%以内,39,2023/1/25,(三)定量下限,1.测定法,取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证,定量下限(LLOQ):标准曲线上的最低浓度点 符合准确度和精密度要求,2.限度要求,准确度应在标示浓度的80%120%范围内,相对标准差(R
17、SD)应小于20%,40,2023/1/25,(四)精密度与准确度,1.测定法,高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品低:LLOQ的23倍;高:ULOQ的80%;中:几何平均浓度同法独立测定3天,方法精密度除评价批内(日内)RSD外,同时还应评价 批间(日间)RSD,2.限度要求,准确度:低,80%120%;中高,85%115%RSD:低,20%;中高,15%,41,2023/1/25,(五)稳定性,1.测定法(高低浓度),室温考察1个工作日(如1,2,4,8或24h)冷藏(4)数个工作日(标准储备液至整个分析完成)冷冻(-20/-80)至整个分析完成冻-融至少经历3个循环,短期稳定
18、性:在1个分析批内,样品室温等待处理;处理后溶液在特定(HPLC进室)温度等待进样期间稳定性 长期稳定性:在整个样品分析期间,体内样品的长期储藏,冻融;以及标准储备液的稳定性,2.期限要求,短期:通常1工作日,不超过3工作日;长期:整个分析完成期限,42,2023/1/25,(六)提取回收率,1.测定法,高中低3个浓度的QC样品,制备至少5个独立的样品另取空白生物介质,照QC样品同法处理,加入等量的标准溶液(必要时除去溶剂)同法处理高中低3个浓度的标准对照样品(不含生物介质),样品处理方法的评价重点在于结果的精密与重现;而非待测物提取的完全与否,2.限度要求,RSD:低,20%;中高,15%,
19、43,2023/1/25,(七)分析过程的质量控制,每个未知样品测定一次,必要时进行复测来自同一个体的体内样品在同一分析批中测定每个分析批,建立批标准曲线;并随行3浓度QC样品 QC样品每个浓度至少双样本,并均匀分布在未知样品顺序(低高/高低顺序均匀穿插整个分析批)中一个分析批内未知样品数目较多时,应同时增加各浓度QC样品数,使QC样品数大于未知样品总数的5%QC样品测定结果的偏差不大于15%,低浓度点偏差不大于20%;允许1/3非同浓度QC样品结果超限不符合上述要求,则该分析批样品测试结果作废,44,2023/1/25,(八)未知样品浓度超限的处理,标准曲线不能外延,浓度超限的样品处理后再测
20、定浓度高于ULOQ部分样品用空白生物介质稀释至规定体积再测定同时制备浓度高于ULOQ的QC样品,同法稀释(浓度不低于LLOQ)后测定浓度低于LLOQ增加样品体积(制备样品浓度高于LLOQ);同法进行QC样品和空白介质试验特异性不降低,准确度和精密度符合要求生物利用度/生物等效性研究,不需处理,45,2023/1/25,(九)作为药用的内源性物质的测定,对生物介质进行处理生物介质通过活性炭滤过、透析等技术去除所含的该内源性物质后,作为空白生物介质使用使用特定生物周期阶段的生物介质 适用于呈周期性变化的内源性物质(如雌激素)使用替代介质 如兔血浆,人血清蛋白,缓冲液,0.9氯化钠溶液等;测得的浓度
21、需进行校正采用标准加入法 适用于内源性物质含量较低的药物;结果为总浓度,46,2023/1/25,(十)微生物学/免疫学方法的验证,微生物学或免疫学分析法的标准曲线本质上是非线性的,应尽可能采用更多的浓度点建立标准曲线如果重复测定能够改善准确度,则应在方法验证和未知样品测定中采用同样的步骤(如双样本分析)微生物学或免疫学分析方法验证实验应包括在几天内进行的6个分析批,每个分析批应包括4个浓度(LLOQ、低、中、高浓度)的质控双样本,47,2023/1/25,(十一)名词解释1,标准物质(reference standard):用于制备标准样品和QC样品的待测物的参比标准在结构上可以是待测物本身
22、,也可以是其游离碱或酸,盐或酯常用的标准物质主要有三种来源:法定标准物质(如ChP标准品或对照品,USP标准品);市售标准物质(来自于具有良好信誉的供应商);或分析实验室或科研机构自行合成和/或纯化的具有一定纯度的化合物生物介质(biological matrix):生物来源的物质,能以可重复的方式采集和处理;如血浆,血清,尿,粪,各种组织,48,2023/1/25,(十一)名词解释2,介质效应(matrix effect):样品中存在除待测物以外的其他干扰物质对响应造成的直接或间接的影响标准样品(standard sample):在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品用于建立标准
23、曲线,计算质控(QC)样品和未知样品中待测物的浓度 质控样品(quality control sample):即QC样品,在空白生物介质中加入已知量待测物标准物质制成的样品用于监测生物分析方法的效能和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性,49,2023/1/25,(十一)名词解释3,介质控样品池(pool of QC sample):由不负责待测样品(未知样品)测试的人员(独立测试人员)在试验研究的初始制备,并与未知样品在相同条件下同时保存制备QC样品池时,不能使用制备标准曲线用的标准溶液,应另行制备(独立制备)需制备额外的QC样品时,应在初始制备的QC样品使用完之前制备,并与初始
24、制备的QC样品同时测定,经检验应无显著性差异未知样品(unknown sample):亦称研究样品(study sample),是作为分析对象的体内样品,50,2023/1/25,(十一)名词解释4,制备样品(processed sample):待测样品经过各步骤(提取,纯化,浓缩等)处理,制成的直接用于仪器分析的试样 分析批(Analytical run/batch):包括未知样品,适当数目的标准样品和QC样品的完整系列由于仪器性能的改善和自动进样器的使用,一天内可以完成几个分析批;一个分析批也可以持续几天完成,但连续测量不宜超过3天,51,2023/1/25,Thank You!,52,2023/1/25,备用图片,53,2023/1/25,备用图片,54,2023/1/25,备用图片,*:含过氧化物；:肝脏毒性,有致癌作用,55,2023/1/25,备用图片,谢谢欣赏,THANK YOU FOR WATCHING,
