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1、血红蛋白的提取和分离,专题5 课题3,两个肽链,两个肽链,四个亚铁血红素基团,思考与讨论血液有哪些成分？,血红蛋白的特点：,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,.血红蛋白的提取和分离,一、基础知识,.缓冲溶液,1.作用:,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液,2.缓冲溶液的组成举例：,.弱酸及其对应的盐:H2
2、CO3 NaHCO3、CH3COOH CH3COONa.弱碱及其对应的盐:NH3。H2O NH4Cl.多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐:NaH2PO4 Na2HPO4、KH2PO4 K2HPO4,.分离蛋白质的方法,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,.概念：,1.凝胶色谱法（分配色谱法）,.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,.凝胶色谱法的原理分子筛效应：,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长
3、，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,琼脂糖凝胶电泳示意图,.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.电泳：,.电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,.常见电泳类型：,琼脂糖凝胶电泳,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,迁移
4、率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小、形状。,电泳迁移率完全取决于分子的大小。,实践训练2.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是()A.糖类化合物 B.脂质 C.蛋白质 D.核酸3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是()A.蛋白质分子所带的电荷 B.蛋白质分子的形状 C.蛋白质分子的相对质量 D.缓冲溶液的pH,C,A,4.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径 B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度 C.将酶或细胞固定在凝胶中 D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度5.在
5、利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高 B.使蛋白质的活性最高 C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷,A,C,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.样品处理：,.蛋白质提取和分离步骤,.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤,思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,洗涤操作：,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。
6、,柜式离心机,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,五倍体积生理盐水；低速段时间离心,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,(2)血红蛋白的释放：,蒸馏水；甲苯,(3)分离血红蛋白溶液：,甲苯层（无色透明）；,脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；,血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；,杂质沉淀层（暗红色）。,过滤：除去脂溶性物质沉淀层和杂质沉淀层。,高速长时间离心,分液漏斗,(4)透析(粗分离)：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,利用透析袋透析
7、,透析过程动画演示,二、实验操作,样品处理粗分离 纯度鉴定,.蛋白质提取和分离步骤,纯化,凝胶色谱法：除去分子较大的杂质蛋白,装配好的凝胶柱,开始进行层析,收集得到的纯化后的蛋白,纯度鉴定,思考下面的问题：,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,实践训练2.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即、和。后
8、三步常用的方法依次是、。,粗分离,纯化,样品处理,纯度鉴定,透析法,凝胶色谱法,SDS聚丙烯酰胺,凝胶电泳,2.(2011深圳模拟)使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程可表示为图中()【解析】选B。,3.下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是()A.前者选择鸡血细胞作为材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好B.样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色C.在DNA粗提取实验中，往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物为止D.
9、洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等,【解析】选A。,8、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是A可采集猪血作为实验材料 B用蒸馏水重复洗涤红细胞C血红蛋白释放后应低速短时间离心 D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,5.以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢,2011广东高考,【典例训练】,【变式训练】(2012揭阳模拟)下列有关提取和分离血红蛋白的叙述中，不正确的是()A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B.通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C.可以通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品的纯化D.可以通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,
