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1、黄芩苷抗金黄色葡萄球菌-溶血素作用机制的确证,指导教师：陈志宝班 级：生物技术姓 名：周薇学 号：20094081129,简介,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus,（简称为金葡菌）是常见的革兰氏阳性致病菌，是极其重要的人兽共患病原体。,1,2,本研究应用定点残基突变和荧光淬灭试验验证黄芩苷与-溶血素的结合位点。通过将-溶血素氨基酸序列中的Tyr148、Pro151和Phe153突变为丙氨酸（Ala），表达和纯化野生型-溶血素及突变体-溶血素，应用荧光淬灭试验测定结合常数，结果表明，突变后的-溶血素与黄芩苷的结合明显降低，结合常数大小为野生型 F153A P151A Y14
2、8A。通过脱氧胆酸诱导的寡聚化和SDS-PAGE验证了黄芩苷对-溶血素七聚体形成的影响。,材料与方法,菌株及载体：金黄色葡萄球菌8325-4 大肠杆菌DH5、BL21主要试剂：PBS缓冲液 Amp 贮液 IPTG 贮液 离子交换缓冲液（Buffer A）离子交换缓冲液（Buffer B）5 mM脱氧胆酸钠溶液 仪器：普通PCR扩增仪 电泳系统 凝胶成像分析系统 超声波细胞破碎仪 Akta purifier 恒温水浴锅 超净工作台 生化培养箱 恒温摇床 紫外分光光度计 制冰机 高速离心机,材料与方法,方法：1 hla及hla突变体的引物设计2 基因组提取3 hla-pGEX-6P-1载体的构建和
3、原核表达4 QuikChange法对hla基因进行定点突变5 Hla重组蛋白和突变蛋白的大量表达和纯化6 荧光淬灭试验7 SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响8 溶血试验,结果,1 hla-pGEX-6P-1载体的构建和原核表达1.1 金黄色葡萄球菌hla基因的克隆及序列分析1.2 重组Hla的可溶性分析1 PCR扩增得到的hla基因电泳图 2 菌落PCR鉴定电泳图 3 重组载体双酶切鉴定电泳图,结果,4不同温度诱导时Hla的表达情况 5 不同温度诱导下Hla的表达形式,结果,2.2 uiQkChange法对hla基因进行定点突变,6野生型hla基因序列和突变型h
4、la序列,结果,2.3 重组Hla蛋白和突变Hla蛋白的纯化,7亲和层析收集蛋白电泳图,8 Hla在Resource S离子交换柱上的色谱图,9 Resource S离子交换后Hla电泳图,10 Hla在Superdex 75柱的色谱图,11 过Superdex 75柱后Hla电泳图,结果,2.4 Hla与黄芩苷结合常数,12 黄芩苷与野生型Hla和两种突变体Hla相互作用的荧光光谱,结果,2.5 SDS-PAGE观察黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla寡聚体形成的影响,13 黄芩苷对脱氧胆酸钠诱导的Hla 寡聚体形成影响,14 黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷阻碍Hla七 聚体形成能力的比较,结论,1
5、通过定点残基突变试验，表达和纯化了野生型Hla和突变体Hla（Y148A、P151A和F153A）；2 通过荧光淬灭试验，测定了黄芩苷与野生型Hla及三种突变体Hla（Y148A、P151A和F153A）的结合常数。结果表明，黄芩苷与三种蛋白结合力大小顺序为：野生型 F153A P151A Y148A，与我们在第二章中理论模拟的结果一致；3 通过脱氧胆酸诱导的Hla寡聚化试验考察了黄芩苷对Hla七聚体形成的影响，结果表明黄芩苷剂量依赖性地阻碍Hla七聚体的形成；此外，还比较了相同浓度的黄芩苷、汉黄芩苷及野黄芩苷对Hla七聚体形成的影响，结果显示其抑制能力的大小为：黄芩苷 汉黄芩苷 野黄芩苷，与第二章模拟的结果一致；4 通过纯化Hla溶血试验比较了黄芩苷、汉黄芩苷和野黄芩苷对Hla溶血活性的影响，黄芩苷抗Hla的IC50为6.63g/ml，汉黄芩苷则为10.27 g/ml，而野黄芩苷对Hla的溶血活性几乎没有抑制作用。,在论文付梓之际，我在此向各位关心帮助支持我的老师同学和朋友致以最真挚的谢意！是他们的支持和辛劳才使我顺利完成多年的学业！谢谢！,Thank You!敬请各位老师批评指正！,
