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1、第12章 高效液相色谱法,high performance liquid chromatography,HPLC,HPLC与经典LC区别,第2节 基本理论-速率理论,一、柱内展宽,Csm为静态流动相传质阻力系数,组分在色谱柱中运行时间不同，导致色谱峰展宽。影响因素：固定相的粒度和填充均匀程度,涡 流 扩散 项 A,减少方法：a 降低dp：目前商品柱多采用3-5m粒径 b 降低：采用球形、均匀分布固定相。,B=2Dm Dm T/,2.纵 向 扩 散 项 B/u,样品分子沿流动相方向产生扩散，所引起峰展宽,3.流动的流动相传质阻力项Cmu,流动相本身，处于不同层流的分子具有不同流速。,Dm T/,
2、减免方法：1）减少固定相颗粒直径 2）减少流动相液体黏度（甲醇）,4.静态流动相传质阻力项Csmu,原因：处于固定相颗粒内部孔洞内静态流动相引起,影响Csmu的因素与Cm相同,5.固定相的传质阻力项Csu,影响因素：固定相内部阻力影响,减免方法：减少固定相液膜厚度化学键合相,6、HPLC法中分离条件的选择,H=A+（Cm+Csm）u,1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱,2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温25-300C左右。太低，流动相黏度增加，太高容易产生气泡,二、柱
3、外 展 宽,减免方法：应尽可能减少柱外死体积,从进样器到检测器之间的体积称柱外死体积，均可导致色谱展宽，柱效下降。,第3节 各类高效液相色谱法,吸附色谱法化学键合相离子对色谱法,一、吸 附 色 谱 法,1分离原理,2固定相：极性和非极性固定相,3流动相：底剂（烷烃）+有机极性调节剂,二、化学键合相色谱法,（bonded phase chromatography,BPC）,化学键合相：采用化学反应的方法 将固定液的官能团键合在载体表面上。,优点：固定相不易流失 适用于各种样品的分离分析,正相键合相色谱法：极性键合相，如氨基柱、氰基柱适用：极性化合物,反相键合相色谱法：非极性键合相，如C18柱、C
4、8柱适用：非极性至中等极性化合物,分 类,1）分离原理 流动相与溶质有排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆的。k，组分tR,1、反相键合相色谱法（RP-HPLC）,2）固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱）十八烷基键合相：常用的非极性键合相,反相键合相色谱法（RP-HPLC）,低碳型：R1、R2都是氯,高碳型：R1、R2是两个甲基 特点：载样量大，保留能力强,键 合 相 分 类,中碳型：R1、R2其中一个是氢，一个为氯,表面覆盖度：参加反应的硅醇基数目，占硅胶表面硅醇基总数的比例。,作用：决定了键合相是分配还是吸附占主导,封尾：为了减少残余的硅醇基
5、，一般在键合反应后，用三甲基氯硅烷等小分子进行钝化处理。,3）流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，四氢呋喃,反相键合相色谱法（RP-HPLC）,4）流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5）出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6）适用：非极性-中等极性组分,反相键合相色谱法（RP-HPLC）,用ODS柱分离苯、甲苯，流动相为甲醇-水（95：5）问：哪个先出柱若要增大tR，应增大甲醇还是水的比例?,例：,1）分离机制：2）固定相：极性大的氰基或氨基键合相3）流动相：极性小 底剂+有机极性调节剂
6、 例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇,2、正相键合相色谱法（NP-HPLC）,4）流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5）出柱顺序：极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱,正相键合相色谱法（NP-HPLC）,6）适用：氰基键合相：与硅胶的柱选择性相似氨基键合相：糖类等,3离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱,
7、3洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）,Phenomenex Luna C18（250mm4.6mm，5m）色谱柱(Aschaffenburg,Germany)。流动相：(A)乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液进行梯度洗脱：0-30min：A 28%，B 72%；30-53min：A 28升至34，B 72降至66；53-70min：A 34升至80，B 66降至20。流速：1.0 mlm
8、in-1；检测波长：275 nm；进样量：20l；柱温：30；,流动相的性质和选择,1、流动相的物理性质,1)流动相要求：易得易纯化，无毒不易燃。检测器的适应性:如紫外检测器对溶剂的透明波长要求；示差折光不能用梯度洗脱对样品有一定溶解度而不反应纯净,低廉,低粘度(510-4Pa.S),低沸点(柱温(2050),2)流动相的物理性质,沸点bp、分子量M、密度、介电常数e粘度、折射率RI、紫外吸收截止波长溶剂强度参数(Al2O3)、溶解度参数(色散d、取向极性0、受质子a给质子h)、溶剂极性参数P/(质子接受xe、给质子xd、偶极xn)、选择性分组、表面张力、离子对色谱溶剂强度(P/+0.25e)
9、,常用于HPLC流动相溶剂的性质,溶剂的强度因素,P/规定：戊烷在Al2O3的=0,(硅胶)=(Al2O3)0.77,混合溶剂?,N摩尔分数;nB为吸附剂吸一个B分子所占面积,吸附剂活性。一般0.61.0,nB=4-6随B分子体积而变化,0：液-固色谱中溶剂强度参数，反映溶剂分子对吸附剂亲和力。经验：0减小0.05，k值增加13倍,溶解度参数,EC是1mol气体变液体释放能量;Vm液体摩尔体积,=色散+偶极+接受质子+给出质子,极性参数P/,Kg为极性分配系数,P:液-液色谱溶剂极性参数，表示溶剂洗脱强度和溶剂的选择性,经验：P改变2单位，k值改变10倍,极性参数P与溶剂强度参数关系投影,粘度
10、参数,注意:溶剂常用0.4-0.5mPa.s,太大柱效下降,大小易成气泡,混合时一般粘度变化非线性,1 2 3 4,水0,B100,1.正丙醇2.乙醇3.甲醇4.乙腈,2、溶剂的选择性与分类(Snyder),K与分子之间作用力？,色散力、偶极力、氢键力,参考物的选择,(Snyder法),强偶极作用-硝基甲烷-Xn质子给予体-乙醇-Xd质子接受体-二氧六环-Xe,参考物与被检溶剂间作用力关系表,表2 Snyder的溶剂选择性分组,混合溶剂P/：?,注:模糊聚类法,把溶剂对质子给予体、质子接受体、电子给予体、电子接受体和定向作用力化合物的选择性五个参数进行分类，选择21种常用溶剂,表 混合溶剂的溶
11、剂特性,举例：在反相色谱中，计算甲醇-水(60:40)的溶剂溶剂强度，如果改用相同强度的乙腈-水溶剂，四氢呋喃和水其比例是多少？,解：查表得甲醇、乙腈、四氢呋喃和水的溶剂强度S分别为2.6,3.2,4.5,0,甲醇-水：S=0.602.6+0.400=1.56,乙腈-水 S=X3.2+(1-X)0=1.56 X=0.49,THF-水 S=X4.5+(1-Y)0=1.56 Y=0.35,2)选择一般原则,正相键合相 反相键合相主体溶剂 正已烷(正庚烷、正戊烷)水选择性溶剂 a.质子接受体 乙醚或甲基叔丁基醚 甲醇*b.质子给予体 氯仿 乙腈*c.偶极 二氯甲烷 四氢呋喃*,3溶剂优化的步骤：,1
12、.首选择溶剂2.多元溶剂系统组成3.洗脱能力的选择(,P/,S)调k重点组分k=(t-t0)/t0 34.改变溶剂系统改变选择性5.混合溶剂优化6.PH缓冲剂、胺、配合物、添加剂离子强度调节剂7.组分性质差别大可用梯度洗脱,如:四面体-三角形法1选择乙腈-水,2.比例100%往下调节确定k值而得最适合的比例.图9-29,3.改变溶剂:甲醇-水;THF-水比例计算找等洗脱强度三角形,图9-30,4.混合溶剂:三元、四元,图9-33,5.七种溶剂流动相色谱分析,图9-34,4、色谱分离条件的优化指标,1)色谱响应系数,其中:P=f/g,n相邻峰对数;tM最大容许时间,tL实际时间，常数,2)色谱优化函数,Ai权重因子,R分离度COF绝对值越大越差,举例取代萘混合物分离的优化试验,色谱柱：Zorbax-C8（1500.46cm）,1.选择溶剂强度使溶质容量因子在110 选择二元溶剂,溶剂%有机 相近似k值(计算值 实验值)乙腈 52 52 0.78 A甲醇 64 63 0.68 B四氢呋喃 37 39 0.67 C,取值:乙腈3.2;甲醇2.6;四氢呋喃4.5水0,2、作下列流动相的色谱图,求=0,Ai=1,Rd为1.2;1.8;2.4时COF值,C:A+B D:B+C E:C+A F:A+B+C,表 Zorbax C8柱上取代萘的COF值,
