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1、血细胞分析仪检测技术及临床应用,血细胞分析仪检测是临床诊断工作中最常用的实验方法之一40年代后期美国库尔特先生(W.H.Coulter)发明了粒子计数技术(电阻抗法),50年代初期应用于血细胞计数,血细胞分析仪检测原理,一.电阻抗法(库尔特原理)1.血细胞具有非传导性质(不良导体)2.E=I x R脉冲信号3.脉冲信号大小与细胞体积成正比4.脉冲信号的多少代表细胞数量,细胞的三分群：各种细胞在溶血剂中，经溶血剂中表面活性剂对细胞膜表面的脂蛋白作用后而分群，由于RBC膜表面的脂蛋白含量最少而易被破坏溶解,白细胞的细胞浆漏出，仅留下核与颗粒并使细胞缩小，原来最大的单核细胞经溶血剂作用后，体积就落在
2、了小的淋巴和大的中性粒细胞之间，这样就按照溶血剂作用后体积大小，将白细胞分成三群。,淋巴细胞：35-90fl;中间细胞：90-160fl;粒细胞160fl依照三群细胞在白细胞体积分布的直方图上所分布区域的面积，计算得出每群细胞的百分比，并依照白细胞计数总数，求得每群细胞的绝对值。注意:各厂家的溶血剂配方不完全相同,对白细胞膜的作用程度不同,而各厂家对仪器的各类WBC区分设置也不尽相同.,RBC及相关参数的检测RBC检测电阻抗原理脉冲信号高度的叠加HCT单个脉冲信号高度的均值MCVRBC:36360fL区间分析RDW:仪器将不同大小的脉冲信号分别贮存在不同通道,计算出相应的体积和数目,再统计处理
3、得到RDW,用RBC体积的CV或SD表示.RBC计数中WBC含量可忽略不计,但在白血病或WBC异常增高时则对RBC及其相关参数有明显影响.,PLT检测:电阻抗原理PLT和RBC一起同时被检测PLT体积分布:228fL,不同仪器的PLT直方图 范围不一.MPV:是PLT体积分布直方图的产物MPV与PLT成非线性负相关PCT参考范围是一不恒定参数PDW:是PLT体积分布直方图的产物PLCR:12fL的PLT比率,浮动界标技术 1.RBC/PLT:为便于识别，在RBC/PLT通道一般把体积大于30f1的细胞计为红细胞(RBC)，而把体积小于30f1的细胞计为血小板(PLT)。一般的血细胞分析仪，PL
4、T和RBC的分界点是固定的(例如30f1处)，这种情况属于固定界标。但也有例外的情况，有些公司的血细胞分析仪，可以把PLT和RBC的分界点人为地设置在5-30f1的范围内，在实测样本时，仪器根据PLT和RBC的分布曲线，自动在所设定的范围内寻找最低点，以得到正确的PLT.RBC及相关参数的结果，这就是浮动界标.,2.WBC:当直方图出来后，由软件程序自动判别并寻找直方图上三个区域的起止点（即第一个高峰起止和第二个高峰地点）作为界标线，并以此为依据进行判读，由于设计理念的不同，稀释液和溶血剂对细胞的作用不同于固定界标，因此，浮动界标的wbc直方图很少有能超过350fl的横坐标。直方图每次的结果是
5、不一样的，因此界标线的位置也是不一样，这就形成界标线的移动，就是浮动界标,Hb检测:与WBC一起被检测SLS-HGB检测血红蛋白：测定原理：亚铁血红素中的Fe2+离子被十二烷基磺酸钠氧化，形成SLS-HGB衍生物，在550nm波长进行比色测定。SLS-Hb法测定与ICSH的参考方法相比，具有非常高的相关性(r=0.999)。,二.血细胞检测技术的发展（五分类）1。光散射法(Scatter):来自激光光源的单色光束在10-70对细胞进行扫描,提供细胞结构、形态的光散射信息。光散射特别具有对细胞颗粒的构型和颗粒质量的区别能力，从而将三种粒细胞区分。利用高低角度光散射可同时对PLT和RBC进行计数.
6、高角(5-15)测量RBC数,检测PLT内容物.低角(1-3)检测RBCPLT体积.,2。电导法 根据细胞壁能产生高频电流的性质采用高频电磁探针，测量细胞内部结构、核浆比、细胞内颗粒大小和密度。电导法可辨别体积相同而性质不同的两个细胞群（如；小淋巴和嗜碱）,3。射频技术；在测量小孔的内外电极装有直流和高频两个发射器，因此在小孔周围产生直流和射频两种电流，直流电仅能测量细胞大小，而射频可透入细胞内，测量核的大小及颗粒的多少。利用阻抗+射频技术可将淋巴、单核、粒细胞区分。,4.过氧化物酶染色技术过氧化氢酶含量:嗜酸粒细胞中性粒细胞单核细胞.淋巴和嗜碱粒细胞无由于酶反应阳性程度不同,通过激光束时的吸
7、光度也就不同,加上光散射及特殊溶血剂的作用可进行五分类.,5.核酸荧光染色技术利用聚次甲基荧光染色液对有核细胞的核酸(DNA/RNA)进行荧光染色。采用半导体激光流式细胞检测，获得WBC/DIFF散点图并得到新的检测参数IG和OTHER。通过对散点图的分析，可获得LYMPH、MONO、EOS、NEUT+BASO及NRBC和Ret的测定结果。最早的全自动网织红分析仪R-1000TM，用荧光染料碱性槐黄；最新采用的是聚次甲基染料，用来进行WBC四分类、网织红细胞测定、有核红细胞测定，该染料被红色半导体激光（波长为633nm）激发后发出660nm或更高波长的红色荧光。,该技术采用检测三种光学信号(前
8、向散射光、侧向散射光、侧向荧光)进行白细胞分类的测定。前向散射光：细胞大小信息。所采集的前向散射光信号用于对WBC/BASO的测定。侧向散射光：反映细胞核及颗粒的信息(主要是颗粒的复杂性)。所采集的侧向散射光信号用于WBC/BASO和WBC/DIFF的测定。侧向荧光：通过对核酸(DNA和RNA)进行染色，荧光信号提示细胞核酸的信息。所采集的侧向荧光信号用于WBC/DIFF 的测定。,三.血细胞分析检测项目的进展1.幼稚细胞的检测:幼稚白细胞膜上的脂质较成熟白细胞为少，使用含有能固化细胞膜和胞浆的硫化氨基酸的溶血剂，由于脂质的成分、含量及在细胞膜上的占位不同，结合在幼稚白细胞上的硫化氨基酸较成熟
9、白细胞为多，使胞膜和浆都固化，对溶血剂中具有溶血作用的非离子表面活性剂具有抵抗作用，加入溶血剂后，成熟白细胞被溶解，而幼稚白细胞得以保存,通过DC检测出幼稚细胞,核酸荧光染色:根据细胞成熟度的不同可以体现在其荧光信号的强弱上，其白细胞分类通道除正常细胞分类外，还有两个幼稚白细胞的定量参数：IG（幼稚粒细胞）和 Other（原始细胞/异常淋巴）,激光照射后产生荧光信号，和侧向散射光一道绘制成二维散点图进行白细胞分类。,利用幼稚细胞(IMI)的检测可应用于外周血干细胞移植(PBSCT).PBSCT技术的关键是确定移植所需PBSC的量和采集PBSC的最佳时机.在外周血幼稚或原始细胞增加的同时,伴随着
10、干细胞的增加,因此IMI+细胞可间接反映PBSC骨髓多能干细胞无法检测,而粒巨噬细胞集落形成单位系造血干细胞分化而来是造血祖细胞(HPC)的一种基于骨髓和外周HPC表达同样的CD34+因此可用流式分析HPC,含CD34+细胞不是单一细胞而是包括原始到不成熟粒细胞的连续分布群。因此在血细胞分析仪上利用幼稚细胞的检测可间接反映HPC,2.有核红细胞的测定将血液和测定有核红细胞的试剂相混合，正常红细胞中的血红蛋白渗出，只剩下光学透明的细胞膜或碎片。有核红细胞和白细胞被试剂中的聚次甲基染料快速渗入。但有核红细胞的核很难和染料结合，因为它的核染色质发生固缩，不易着色。着色后的细胞排成流式细胞，并被633
11、nm的红色激光束照射，测得细胞所产生的前向散射光强度和侧荧光强度。二维散射图的横坐标表示侧荧光强度、纵坐标表示前向散射光强度。,以前检测有核红细胞的分析系统中，用酸性低渗性盐溶液作为溶血素，用PI（propidium iodide）或EB溴化乙啶（ethidium bromide）染有核红细胞的核，但是该方法不能从损伤（死亡）的淋巴细胞中区分有核红细胞,3.网织红细胞检测(血细胞分析仪器)1.用新亚甲蓝(A 液)染红细胞内RNA;再用含透明剂的硫酸(B 液)使红细胞内血红蛋白溢出,成为影细胞,处理后的血液在仪器上应用VCS原理进行检测(Coulter)2.将抗凝全血加入网织红细胞试剂(氧氮杂芑
12、750)中，孵育1545 min上机测定，数据分析由仪器中网织红细胞分析程序完成，无需人工干预。(Technicon H*3)此两种方法均为人工机外染色,3.Sysmex 早期采用碱性槐黄作染料,用于网织红计数仪(R系列).后采用激光流式原理和细胞核酸染色。除了进行自动的 RET 数目和百分比计数外，还可以通过核酸染色得到的荧光信号强度区分低、中、高荧光强度的网织红（LFR、MFR、HFR）。由于幼稚的网织红荧光信号较强，MFR 和 HFR 之和即反映未成熟网织红的一个有用参数RMI.(XE-2100、XT-2000i)。,4.运用免疫表型法配合VCS检测技术分析CD4、CD8白细胞亚群先以抗
13、CD4及CD8的抗体包被乳胶球标记CD4、CD8阳性细胞，被标记的细胞在激光散射的特性方面与其它细胞明显不同，上机后可被仪器识别并计数。可在5分钟内快速得到CD4、CD8细胞的绝对值、百分比、和CD4CD8比值,5.网织血小板检测 网织血小板（Reticulated Platelets,RP）是从骨髓释放入血的新生血小板，与成熟血小板相比，体积大，蛋白质合成能力强，RNA含量多。1 网织血小板的得名:1969年国外学者应用新亚甲蓝染料,对犬外周血进行染色，发现血小板内有一种网状结构物，故将这一部分血小板命名为网织血小板 2 网织血小板检测方法:荧光色素-噻唑橙（thiazole orange,
14、TO）。奥黄O（Auramine O,AO）,四.保证计数精密度准确性的技术1容量限定:稀释液容量控制 浮球定量2控制细胞通过小孔时及计数准确性的技术 重叠校正 脉冲编辑 高精度体积分析 扫流技术 鞘流技术 浮动界标技术 延时 计数 电子拟合曲线,在目前国内众多的五分类血液分析仪当中，主要品牌有：光电、ABX、东亚，库尔特、雅培、拜尔,COULTER MAXM五分类血细分析仪集库尔特原理及VCS技术于一身，提供完整的白细胞五项分类和全血细胞计数 运用流体动力（鞘流）令细胞成单一排列，逐个通过检测位置，每个细胞同时接受VCS三项技术的测量，VCS测量技术包括细胞体积(V),细胞传导性(C)及细胞
15、激光散射性（S）。以活性染料新亚甲蓝（NMB）对网织红细胞进行染色，漂清本底后，运用激光散射技术从成熟的红、白细胞和血小板中辨别出网织红细胞并计数。,XE-2100 XE-2100采用了先进的半导体流式细胞分析系统结合核酸荧光染色技术，是目前世界上速度最快的血液分析仪器（150个标本/小时）；同时还可以为临床提供更多的定量的检测参数，包括有核红细胞（NRBC）、造血祖细胞（HPC）、未成熟粒细胞（IG）、网织红细胞（RET）等36个参数；XE-2100具有7种检测模式，可以随机任选进样；同时还具有强大的联网功能及可拓展为血液分析流水线。XE-2100使用电阻抗光学两种方式，提供可靠的血小板计数。新参数：NRBC，IRF（不成熟网织红细胞分布），HPC*(造血原始细胞)，IG*（不成熟粒细胞）。,
