二维核磁共振谱2.ppt

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1、二维核磁共振谱,（2D NMR）two-dimersional NMR spectra,第一节 概述,发展1971年Jeener首先提出二维核磁共振谱方法。1976年Ernst确立了2D NMR的理论基础。1991年10月Ernst荣获了诺贝尔化学奖。,作用与特点有利于复杂谱图的解析。减少了谱线的拥挤和重叠。提供了核之间相互关系的新信息。,用一个相似的例子说明二维核磁共振处理复杂谱图的基本原理。,异核位移相关谱中一维是一类核，例如13C、15N或31P的谱图另一维是与之偶合的核，通常是1H的谱图 在等高线图上的每个峰同时表示两种核,同核二维J分解谱是把化学位移与偶合常数分开，使复杂谱图易于辨认

2、同核二维化学位移相关实验则是测定同核偶合的有力工具 异核化学位移相关实验则可以给出直接或远程异核偶合的关系,第二章各部门安全注意事项,1.0房务部1.1前台班组1.1.1认真查验旅客身份证件（外籍客人要查验护照、签证），按规定项目如实登记。1.1.2验证无误后，方可发放房卡（团队、要客可特办）。1.1.3以下情况应重点注意：a.订房时，不讨价的b.证件不符或存在疑问的c.没有携带行李,第二章各部门安全注意事项,d.登记入住时东张西望者；e.登记时故意掩盖面部或有意回避监控器者；f.登记入住前，要求参观房间或形迹可疑者；g.寄存于前台的行李，要检查是否属于危险品，检查有无破损、要点清数量、挂好行

3、李卡，存放行李的房间应严禁闲杂人等进入，同时做好与客人或下一班次的交接。1.1.4关注频繁换零钱者。,2.成功地用于解析溶液中复杂的生物大分子的化学结构。可测定中等大小的蛋白质及分子量高达15000的核苷酸片断测定溶液中蛋白质的立体结构,测定生物大分子构象的实验方法 单晶X射线衍射：只适用于单晶样品，只能给出固态构象，有较强局限性。2D NMR：研究溶液中生物大分子构象的唯一技术。,3.应用NMR检测分子中特定的原子，1H、13C、15N等 分子中原子之间通过化学键传递的J偶合连接方式通过空间传递的NOE联结方式获得更精确参数（化学位移、偶合常数、NOE值、弛豫时间）,什么是二维核磁共振谱,与

4、一维谱的区别 一维谱的信号是一个频率的函数，记为S（）二维谱是二个独立频率（或磁场）变量的信号函数，记为S（1，2）二维谱两个独立的自变量都必须是频率,分辨信号峰数不同 一维谱中1H谱最多有66组多重峰可以彼此完全分解开 13C谱可以分辨5000条不同的信号峰 二维谱中是用面积单位（Hz）2，分辩的信号峰的数目可多于100000条,2.三种获得方式,（1）频率域实验（2）混合时域，频域实验（3）二维时域实验（主要方法）,把整个时间轴按其物理意义分割成四个区间,2D NMR检测原理示意图,图4 a获得二维时间域函数示意图 b 二次傅立叶变换示意图,3.二维谱的实验过程与方法 实验过程 t1从小到

5、大，每次等量增加t1，做大量重复实验，得到一组不同t1值的关于t2的响应 对不同t1值的所有子实验总体（一次完全实验）重复P次，使灵敏度增强P1/2倍 实验得到的时域信号S（t1,t2）构成一个数矩阵，每个取样点对应于一个矩阵元（t1,t2）=（nt1，mt2）,图5 二维傅立叶变换过程图,实验方法 必须备有脉冲持续时间、等待时间和相位等均能自由改变的脉冲程序 必须用大存储量的辅助记忆装置，快速的激光打印机，陈列数据处理器，梯度场探头等新技术装备 要求磁场能长期稳定，并采用灵敏度高的超导高场仪器,4二维谱的记录 多线记录法（叠迹图或堆积图）,等值线图（也称等高线图）,截面图,积分投影图,5.二

6、维谱的物理表示方法,（1）相敏谱,（2）功率谱,（3）绝对值谱,6线型和相位,一般采用功率显示或绝对值显示，它们都不保留相位的正负特性。功率显示，分辨率好，但强度严重畸变，所以通常采用绝对值模式，但由于色散的影响，它往往有很长的尾巴。由于存储量与实验时间的限制，通常发展期取的点数有限，因此在t1维上会引起比一维谱更严重的截尾效应。而通常用的绝对值模式，受虚部影响很大，因此在二重傅立叶变换前作适当的权函数处理是个关键。对于二维谱，用指数窗函数不如一维谱有效，而普遍采用高斯型与卷积差型权函数。高斯型权函数给出很好的分辨率，但要求要有很高的灵敏度，并要求不同谱线的线宽相同，使用时应十分注意。,7二维

7、谱共振峰的命名,对角峰（Auto peak）位于对角线（1=2）上的峰，称为对角峰。这意味着在发展期和监测期的进动频率相同，而且在混合期中未发生相干转移。对角峰在F2和F1轴的投影，视不同的实验方案而得到常规的偶合谱或去偶谱。,交叉峰（Cross Peak）：出现在21处（即非对角线上），它表明存在（m n）（kl）的相干转移，在发展期的进动频率不等于检测器的进动频率。从峰之间的位置关系可以判定哪些峰之间有偶合关系，从而得到哪些核之间有偶合作用，交叉峰是二维谱中最有用的部分。,轴峰（A xial Peak）出现在F2轴（1=0）上的峰，称为轴峰。轴峰是由发展期在Z方向的磁化矢量转化成为检测期可

8、观测的横向磁化分量，它不受t1函数的调制，不含任何偶合关系的信息，但它含有在发展期中纵向弛豫过程的信息。由于轴峰的信号很强，尾部又长，使谱中许多有用的小信号被淹没而不能分辨，因此应尽量设法抑制轴峰。,8.二维核磁共振谱的分类,1）J分辨谱（J resolved spectroscopy）亦称J谱，或称为J谱，它把化学位移和自旋耦合的作用分辨开来。J谱包括异核及同核J谱。2）化学位移相关谱（chemical shift correlation spectroscopy）也称为谱，是二维核磁共振谱的核心。它表明共振信号的相关性。有三种位移相关谱：同核偶合、异核耦合、NOE和化学交换。3）多量子谱（

9、multiple quantum spectroscopy）通常所测定的核磁共振谱线为单量子跃迁（m=1）。发生多量子跃迁时m为大于1的整数。用脉冲序列可以检出多量子跃迁，得到多量子跃迁的二维谱。,第二节 J分辨谱（J resolved spectroscopy）,同核J谱（1H-1H 2DJ分解谱）1.脉冲系列,2.同核AX体系横向磁化矢量在xy平面上的运动A核的宏观磁化矢量 经90 x脉冲之后，在一个发展期的一半（t1/2），各自旋核按其特定频率进动，磁化矢量相继聚焦在xy平面上。A核的两个横向磁化矢量M（A1）与M（A2）在xy平面上逐渐分散开，它们所对应的信号强度分别为IA1与IA2。

10、,设M（A1）在xy平面上转动的角速度于180 x脉冲之前为2（A+J/2）正向旋转，180 x脉冲之后为2（A-J/2）反向旋转；M（A2）在xy平面上转动的角度则是在180 x脉冲之前为2（A-J/2），180 x脉冲之后为2（A+J/2）。,设横向磁化矢量与y轴构成的夹角为，其对应的核磁信号则正比于ei。在第二个t1/2的终点有：A1=-Jt1 A2=+Jt1,需注意，在t2（采样时间）开始之后，横向磁化矢量在xy平面上转动的角速度不再改变，所以有：A1=（-Jt1）+2（A-J/2）t2 A1=（+Jt1）+2（A+J/2）t2,A核、X核矢量的信号强度关系式IA1ei(-Jt1)ei

11、(2A-J)t2IA2ei(+Jt1)ei(2A+J)t2 IX1ei(-Jt1)ei(2X-J)t2IX2ei(+Jt1)ei(2X+J)t2,同核AX体系J谱 经转动后同核AX体系J谱,3.同核AX体系J谱,同核AX2、AX3体系可仿照上述讨论，最后所得的结果都是类似的：2方向反映化学位移，在2方向的投影为全去耦谱图，化学位移等价的一种核显示一种峰；1方向反映了峰的裂分情况，耦合常数值及峰组的峰数（三重峰、四重峰）一目了然。,4.同核J谱的应用 例1：拓普霉素（tobramycin）其结构式（平面表示）,构象未知 即不知道各取代基是处于六员环的平伏键还是直立键。由于在六员环体系中JaaJa

12、eJee，因此若能完成六员环上各剩余氢的指认，根据各氢的峰组的J值，即可确定环上的氢是处在直立键还是平伏键。据此，取代基的方位也就被确定了。,拓普霉素的核磁共振氢谱,拓普霉素的同核J谱,例2：丙烯酸2D-J分解谱,异核J谱（1H-13C 2D-J分解谱）1.脉冲系列,例：维生素H异核J谱,2.异核AX体系横向磁化矢量在xy平面上的运动与角速度在第一个t1/2的终点：A1=2（AJ/2）t1/2A2=2（AJ/2）t1/2,在第二个t1/2的终点：A1=2（AJ/2）t1/22（AJ/2）t1/2=-Jt1 A2=2（AJ/2）t1/22（AJ/2）t1/2=Jt1,在第二个t1/2终了时，与同

13、核J谱不同，现在是对X核去耦并同时开始对A核采样，A核两个横向磁化矢量在xy平面上的位置相对不变（因J引起的附加转动被去除），二者在xy平面上转动的角速度相同，都是2A A1=（-Jt1）+2At2A2=（+Jt1）+2At2,3.异核AX体系J谱 异核J谱的2方向的投影如同全去耦炭谱。1方向反映了各个碳原子谱线被直接连接的氢原子产生的耦合裂分：甲基显示四重峰，CH2显示三重峰，CH显示双重峰，季碳显示单峰。,4.异核J谱较少应用的原因1.由于DEPT等测定碳原子级数的方法能代替异核J谱，前者操作方便也省时 2.下面紧接要介绍的异核位移相关谱（H，C-COSY）也可以同时起到异核J谱的作用,第

14、三节 异核位移相关谱,H，C-COSYCOSY是correlated spectroscopy的缩写。H，C-COSY是1H和13H核之间的位移相关谱，它把直接相连的1H和13C关联起来。位移相关谱的F2、F1轴都表示,1.异核位移相关谱的脉冲序列,2.例：一种生物碱的C.H-COSY谱,3.位移相关谱产生的原理,氢的磁化矢量运动,碳的磁化矢量运动 在d点（180脉冲之后），碳的两个磁化矢量转到-z轴方向，经过1H的90 x脉冲（g点），对13C进行了极化传递，13C的两个磁化矢量分别沿z轴方向，其强度增强到H/ccos(2H t1+2H 1/2J+/2),H，C-COSY的例子,-维生素E的

15、结构式,COLOC谱,COLOC是（heteronuclear shift）correlation spectroscopy via long range couplings的缩写，即“长程耦合的（异核位移）相关谱”。Kessler等人于1984年首先提出COLOC这个术语及其脉冲序列9。,特点 从二维谱的功能来看，COLOC与长程H，C-COSY相近，但COLOC效果较好，因而应用亦广泛。COLOC之所以重要在于它能反映跨越两三根化学键的13C与1H核之间的耦合关系，甚至能跨越杂原子，因而对于推测结构很重要。,确定季碳原子的连接关系时，COLOC更为重要。确定肽类化合物（peptide）氨基

16、酸残基的序列（sequence）,2.COLOC的脉冲序列,COLOC脉冲序列优点 COLOC的时间间隔较短，有利于信号的增强 在COLOC的脉冲序列中，仍有两个t1/2，它们分别处于180脉冲的两侧，因而13C核的化学位移仍和1H核的化学位移相关起来 COLOC中1方向没有1H核之间的耦合裂分，但有去耦相关峰,COLOC的图例,H，X-COSY（氢核和其他杂原子的相关谱）1.特点主要针对13P，15N核 含磷或含氮的化合物往往在生物化学中占据重要的地位。磷存在于脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）、腺三磷（ATP）等之中，氮则存在于氨基酸之中。,2.H，P-COSY的例子,1，3，2-

17、二氧磷杂环己烷衍生物,化合物（C4-4）的H，P-COSY,1H谱复杂性原因 分子无对称面 31P参与耦合裂分 存在两种异构体,第四节 同核位移相关谱,COSY（最常用的同核位移相关谱）COSY脉冲序列如图,COSY的识谱方法及其功效例子化合物（C4-5）系由合成得到，其结构式如下,氢谱 ppm1.63 羟基 1.38 CH3 7.27单取代苯环2.93和3.02 CH23.1到4.3峰复杂,谱图的复杂性因素 存在手性碳原子。耦合关系复杂：既有2J，也有3J；3J又有多个数值，如JacJbc，JdcJec。一些氢的值相差不大，构成强耦合体系，谱峰密集。,化合物（C4-5）的COSY局部,2CO

18、SY的一般情况介绍 COSY的2（F2，水平轴）及1（F1，垂直轴）方向的投影均为该化合物的氢谱，一般列于上方及右侧（或左侧），也可以只在上方列出该化合物的氢谱。COSY谱本身则为一正方形（若F1与F2刻度不等则为矩形）。,正方形中有一条对角线（一般为左下-右上）。对角线上的峰称为交叉峰（cross peaks）或相关峰（correlated peaks）。每个相关峰或交叉峰反映两个峰组间的耦合关系。COSY主要反映3J耦合关系。当3J小时（如二面角接近90，使3J很小），也可能没有相应的交叉峰。,由于谱仪的不稳定性等原因，COSY图中常会见到一些垂直状的条状斑点，称为t1噪音。对称化处理是一

19、种操作，因COSY的交叉峰是在对角线两侧对称分布的。,相敏同核位移相关谱（相敏COSY谱）1得到相敏COSY谱的方法 第一种方法是由States等人提出的。它们分别对t1进行复数傅里叶变换，最后加和得到实数信号，即吸收信号 另一种方法是由Marion和Wuthrixh提出的，对t1进行实数傅里叶变换，最后得到纯吸收线形的峰组,2作用与特点 相敏COSY分辨率大为改善谱峰的精细结构易于读取耦合常数谱图的信噪比也有一些改善,AX、AMX、A3X和A3MX体系相敏COSY,图说明：（1）图中仅列出了交叉峰，对角峰未画出。对相敏COSY来说，交叉峰调为纯吸收线型，对角线峰则为色散型。（2）图中的实心和

20、空心圆圈分别代表正、负吸收信号。（3）圆圈的面积代表峰的强度。（4）圆圈旁边的粗线标注主动耦合;细线则标注被动耦合。,例：马钱子碱的相敏COSY（高场部分）,马钱子碱的相敏COSY（高场部分）图,COSY-45(-COSY）1脉冲序列说明 同核位移相关谱的脉冲序列由两个90的脉冲组成。设第二个脉冲角度为度，若为45 一般而论，第二个脉冲角度为30-60，若为45，故称为COSY-45。,2作用,马钱子碱的COSY-45（高场部分）,COSY-45有下列两点作用：对角线峰沿对角线的宽度降低，这有利于发现强耦合体系之间的相关峰。从COSY-45可判别耦合常数的符号2J和3J,1方向去耦的COSY

21、1.1方向去耦的COSY的脉冲序列,2对比COSY的脉冲序列，两点不同 在两个90脉冲序列，增加了一个180脉冲，正是以它来调节t1的变化。两个90脉冲之间的时间间隔是一个固定的时间,特点这样的二维谱和通常的COSY从2方向来看是相同的，无论是二维谱中的交叉峰还是上方的投影，都显示耦合裂分。即2上方的投影是正常氢谱：交叉峰的2方向显示精细结构。,从1方向来看，和COSY相比则明显不同。1方向的投影，即侧面的氢谱是去耦的氢谱，仅显示一个个孤立的单峰 COSY中的交叉峰则不呈矩形外观，而是被“压”成一条条的水平状的交叉峰，这样的结果是大大增加维方向的分辨率。,COSYLR（长程耦合的COSY谱）（

22、COSY optimized for long range couplings）1特点 长程耦合的耦合常数一般均小 从反映长程耦合的交叉峰（相关峰）来确认长程耦合的存在，比观测峰宽度的变化可靠,2COSYLR的脉冲序列,COSYLR的脉冲序列仅在于把COSY脉冲序列中的第二个90脉冲的前面和后面各加了一个时间间隔 在第二个90脉冲的前后，各增加一个，等于分别给t1和t2加了一个较大的量 的加入，使能有效地传递弱耦合作用 当小时，大的J的交叉峰及对角线峰将是主要的：随着增大，长程耦合交叉峰的强度增大,马钱子碱的COSYLR（高场部分）,3作用与实例,第五节 NOE类二维核磁共振谱 由于NOE对确

23、定有机化合物结构、构型和构象的作用及对生物分子能提供重要信息（如确定蛋白质分子在溶液中的二级结构），故NOE类二维谱在二维谱中占有重要的地位。,NOESY（二维核Overhauser效应谱）二维NOE谱简写为NOESY（2D-nuclear Overhauser effect spectroscopy）是通过同核1H，1H间可发生交换弛豫的关系检查相关1H核间距离的实验方法。,1NOESY的基本脉冲序列由三个非选择性的90脉冲组成：90-t1-90-m-90-t2由该脉冲序列（或其改进形式）可以得到NOESY，也可以得到反映化学交换的二维化学变换谱（2D chemical exchange s

24、pectra）或反映有机化合物构象相互转变的二维谱。,2脉冲序列产生NOESY的机理 第一个90脉冲使各宏观磁化矢量从Z轴转到Y轴，产生相应的横向磁化矢量 第二个90脉冲使横向磁化矢量从xy平面转到xz平面，在z轴方向产生纵向分量,第二个90脉冲结束时，有:MzA(t1)=-MoAcos(A)t1 式中：MzA(t1)为在t1结束时刻（因脉冲作用时间为微秒数量级，t1结束时也就是第二个90脉冲结束时）A核纵向磁化矢量的大小；M0A为平衡状态时A核的宏观磁化矢量；A及分别为A核的共振圆频率及旋转坐标系的旋转圆频率,第二个90脉冲开始混合期m。设X核靠近A核，二者之间有偶极-偶极相互作用。发生交叉

25、驰豫，产生了NOE 第三个90脉冲使MZX转到xy平面，产生X核的横向磁化矢量,X核的与NOE有关的时畴谱信号为 Sx(t1，t2)=CMoAcos(A)t1ei(x-)t2,由式可知，所检出的X核的信号被与它有NOE的A核的共振频率所调制，因此这样的二维谱把有NOE的核对关联起来了,表达方式NOESY可以相敏的方式表示，即作相敏NOESY。此时图中的相关峰有正峰和负峰，分别表示正的NOE和负的NOE。NOESY或相敏NOESY的外观与COSY类似，其差别仅在于对角线的交叉峰不是表示的耦合关系而是NOE关系。,COCONOSY COCONOSY是组合的COSY-NOESY（combined C

26、OSY-NOESY)的简称。COSY和NOESY的结合，可以完成对肽类分子氨基酸残基序列的指认，得到其二级结构的信息。对生物分子分别进行COSY和NOESY采样时，费时较长，若生物分子稳定性不是太高，样品可能会有一些变化。,脉冲序列,图(A),(B)和(C)的对比可知，节省了实验时间，而且COSY和NOESY完全是同时进行的，实验条件完全是相同的：包括温度,pH，谱图的分辨率，活泼氢的氘代程度，样品的变化等。,ROESY ROESY是旋转坐标系中NOESY（rotating frame Overhauser effect spectroscopy）的缩写 ROESY的脉冲序列如图,ROESY的

27、表达式,最后一个式子，说明ROESY中，不会出现零数值,HOESY HOESY是异核NOE谱的缩写（heteronuclear NOE spectroscopy）的缩写。HOESY和NOESY是相近的，只不过后者找出空间位置相近的氢核，前者则是找出空间位置相近的两个种类不同的核。,HOESY的脉冲序列,HOESY的谱图则与H，C-COSY相似，差别在于后者的交叉峰反映的是与之间的键连耦合关系，而HORSY的交叉峰则反映的13C和1H之间的NOE关系，即它们在空间的距离是相近的,第六节 多量子二维核磁共振谱 2D INADEQUATE 谱图中相互连接的交叉峰以对角线对称 应用该谱可正确地制定各碳

28、的化学位移，它是确定分子骨架的有力手段。,1INADEQUATE（incredible natural abundance double quantum transfer experiment）是确定碳原子连接顺序的实验 通过13C-13C的耦合从而找到它们之间的连接关系 INADEQUATE实验的灵敏度很低,2INADEQUATE的脉冲序列,脉冲序列说明在作此实验时，对1H进行宽带去耦，所以碳的谱线不被氢核耦合裂分 经90,180,90所产生的S2来自分子中两个相互耦合的13C核，两个耦合的13C核的二自旋体系和能级的相干性，因此称为双量子相干性。经过读出脉冲90()的作用，S2成为一个可检

29、测信号,此脉冲序列，得到一维的INADEQUATE谱，即显示碳-碳耦合裂分的碳谱。若某两个碳原子的谱线簇含有相同的裂分间距，这表明它们具有相同的耦合常数，即它们是相连的,3一维INADEQUATE谱存在下述缺点 当化合物全去耦碳谱谱线靠近时，显示碳-碳耦合裂分的一维IJADEQUATE谱谱线相互重叠，不易相互分辨，从1J来确定相邻碳原子经较困难 一个碳原子和几个碳原子相连，其1J不等，为找出两两相邻的碳原子，需要分辨率很高 要求较好地抑制S0信号,2D INADEQUATE谱 二维INADEQUATE则可克服上述缺点。它所用的脉冲序列仅和上述序列有一点差别：把变成了t1。经t1的作用，产生了相

30、互连接的碳原子的相关,-维生素E的2D INADEQUATE谱图F2方向是碳谱，F1方向双量子频率，该频率正比于相互耦合的一对碳原子的化学位移的平均值 在2D INADEQUATE谱中有一条1=22的准对角线,所有耦合的（相邻的）一对碳-13核，在同一水平线上(1相同)，左右对称地处于准对角线的两侧且2分别等于它们的值，处有相关峰 据此可以找出相邻的两碳原子，进而可以连出整个分子的碳原子骨架,1H的二维双量子核磁共振谱 2方向为1H核的化学位移：1方向仍为双量子频率 从准对角线两侧对称分布的一对相关峰分别往2维方向作垂线，可找到两种氢核的峰组，这两种氢核是邻碳上的氢,二维双量子谱较COSY有如下的优点：无对角线峰，图面干净，不存在对角红峰掩盖邻近的相关峰的问题 二维双量子谱除显示3J耦合的相关之外，还反映长程耦合的相关，区分等价核的耦合体系(如AX、AX2),