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1、高通量测序（NGS）在临床精准诊断中的应用,高尚先先 研究员 博导中国食品药品检定研究院,高通量测序成本迅速下降,第一次人类基因组测序耗时13年，成本30亿美元，到2008年11月，基因组测序仅需一两周，花费10万美元。新一代仪器可将全基因组序列测序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百万分之一。而且随着技术进步，仍在不断下降。,成本快速下降，测序领域的超摩尔定律助推临床应用,测序设备发展现状,3,第一代（稳定需求）ABi3130 xL(FDA CFDA)3730 xL3500 xL（FDA CFDA）,第三代Life Technologies(ABi)Ion Torrent PGMHe
2、licos BiosciencesHelicos Genetic Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem,第二代（高速发展）RocheGenome Sequencer FLX System GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq 2000HiSeq 2500Life Technologies(ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemDanaherMotionPolonator G.007Complete Genomi
3、cs无锡艾吉因生物信息技术有限公司AG-100深圳华因康基因科技有限公司（CFDA）Pstar-1中科院北京基因组所/半导体所BIGIS-1BIGIS-4,各类高通量测序技术原理,高通量测序技术在临床中的主要应用范围,出生缺陷相关分子诊断中的应用无创产前检测领域中的应用（NIPT）染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq）胚胎植入前遗传学筛查领域中的应用（PGS）肿瘤相关分子诊断中的应用遗传性肿瘤突变检测（Germ line）肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）液态活检（Liquid Biopsy）,出生缺陷防治，任重而道远。,“据估计，目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右,每年新增出生
4、缺陷数约90万例。出生缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且影响整个国家人口素质和人力资源的健康存量，影响经济社会的健康可持续发展。”中国出生缺陷防治报告（2012）,出生缺陷分为染色体疾病、单基因和多基因疾病,NGS在无创产前检测领域中的应用（NIPT）,NIPT的科学基础 血浆游离胎盘DNA,胎儿游离DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA）Lancet.1997,无创取样-抽血孕周范围广 12周到26周质控容易 不依赖孕妇年龄孕周等因素、容易建立标准实验规范不受上一胎影响,NIPT相较临床常见产前检测技术的优势,多国出台NIPT指南,国际专业协会发表NIPT指导意
5、见美国妇产科医师学会（ACOG）和美国母胎医学会（SMFM）美国遗传学咨询协会（NSGC）国际妇产科超声协会（ISUOG）国际产前诊断协会（ISPD）加拿大妇产科医师协会（SOGC）美国医学遗传学及基因组学学院（ACMG）意大利母胎医学协会 美国都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）认证机制，无FDA批准公司 ACAOG 20150626,2015.1.15 卫计委妇幼司,我国NIPT临床应用政策法规,目的：完善技术规范明确在孕产妇人群中的适用范围界定其在整体产前筛查与诊断服务体系中的合理定位规范服务流程提高服务质量和管理水平高通量
6、基因测序产前筛查与诊断技术规范（试行）,NIPT的临床质量控制,21三体综合征99%18三体综合征97%13三体综合征90%,检出率,复合假阳性率不高于0.5%,假阳性率,复合阳性预测值不低于50%,阳性预测值,复合假阴性率约为0.3%,假阴性率,胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫局限性胎盘嵌合，cpm）现象是由于发育造成的，机制主要是受精卵发育早期的染色体纠正，在正常孕妇群体里发生率约千分之1-5，是nipt假阳性发生的主要原因。这种现象在生殖领域（pgs）也存在，具体指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生比例要比孕期cpm高，大概1-10%，因为研究难度较大，具体数字还没有共识。,N
7、IPT的未来发展空间大,测序深度,染色体非整倍体 唐氏综合征、爱德华氏综合征、等,染色体微缺失微重复综合征 Digeorge综合征、猫叫综合征、等单基因病 耳聋、地中海贫血、苯丙酮尿症、等,NGS在染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq）,CNV-Seq应用领域,流产原因查找产前（羊水、脐血）检测 不孕不育原因查找染色体疾病先证者的染色体异常检测,CNV-Seq技术操作流程,CNV-Seq针对的人群,产前诊断：具有染色体疾病家族病史的夫妇死胎、反复性流产，需要查明原因的夫妇曾经生育有出生缺陷患儿的孕妇染色体核型分析结果为正常，但超声显示结构异常的胎儿及其父母胎儿宫内发育迟缓先证者遗传病诊断
8、：染色体核型分析正常，但临床表现为发育迟缓、智力低下、自闭、各种畸形、生育障碍等的患者及其父母其他医学检测为染色体疾病，需要确诊的患者,NGS在胚胎植入前遗传学筛查中的应用（PGS),PGS临床流程,检测内容：全部染色体非整倍体大于4Mb的新发的染色体微缺失/微重复大于1Mb的遗传自父母的染色体微缺失/微重复使用范围:高龄患者（35岁）有反复流产史的患者（自然流产3次）反复胚胎种植失败的患者（失败3次）生育过染色体异常患儿的夫妇自身染色体数目或结构异常的夫妇严重的男性不育（SMF），少弱精子症、畸精症自愿接受胚胎染色体异常排查的夫妇,PGS检测内容及适用范围,对NGS在PGS应用的思考,高灵敏
9、NGS技术的测序环境防污染系统的建立 单细胞测序 操作者脱落细胞的污染？样本与植入物的一致性问题 胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫局限性胎盘嵌合，cpm）现象在生殖领域（PGS）也存在，具体指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生比例大概1-10%，因为研究难度较大，具体数字还没有共识。注册审批的难度 1)国家标准物质研制 2)临床试验的难点?,NGS在肿瘤分子诊断中的应用,*每10万人发病人数*每10万人死亡人数数据来源：全国肿瘤登记中心的2012中国肿瘤登记年报,前十大肿瘤发病占肿瘤整体发病比例76.39%前十大肿瘤死亡占肿瘤整体发病比例84.27%,发病率*每年新发3,120,00
10、0人,死亡率*每年死亡2,700,000人,肺癌，54人胃癌，36人结直肠癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲状腺癌，7人,肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人结直肠癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人脑癌，4人淋巴癌，4人,多种临床肿瘤分子诊断需求,全面的基因检测,多种样本类型,可进行疗效监测,靶向用药相关基因化疗用药相关基因肿瘤易感性相关基因检测肿瘤发生相关基因检测,血液样本小标本组织样本大标本组织样本,准确定量,遗传性肿瘤突变检测（Germ line）,临床应用：检测多种肿瘤的患病风险；检测肿瘤基因型，判定家系成
11、员患病风险；指导肿瘤个性化治疗。,科研应用快速、低成本的探索肿瘤相关基因的突变；若采用毛细管测序的技术，一次只能检测一条DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA样本。、茱莉 BRCA1阳性,针对肿瘤基因外显子或SNP多态性位点进行NGS检测。,肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）,Industry Guidelines,Emerging and Clinical Trials,指导肿瘤的个体化治疗,很多肿瘤患者无法进行活检或手术；穿刺受检者严重不适感；穿刺自身的临床风险；取材时间点受限，很难进行多次取样；肿瘤异质性。,基于组织的肿瘤体细胞突变检测的局限性,液态活检(Liquid
12、Biopsy),Speicher M R,Pantel K.Tumor signatures in the bloodJ.Nature biotechnology,2014,32(5):441-443.,循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)游离肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)目前看，ctDNA更适合做液态活检,作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药,实现实时动态监测，预测耐药及复发 提高全程管理水平,指导用药,实时监测,循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性,匀质标本,未来可用ctDNA血液检
13、测进行突变状态的动态耐药复发监测,肿瘤类型繁多，分子突变特点不一；高灵敏度定性、定量检测，技术分辨率要求高；ctDNA来源复杂，不同肿瘤患者个体差异较大，数据解读与注释需谨慎；目前仍局限于晚期肿瘤的临床应用；需要大规模、多中心临床验证数据。,ctDNA检测技术面临的挑战,对NGS在肿瘤应用的思考,肿瘤风险易感基因检测对诊断的价值？数据库的积累？预测的精准性？23and me？2013年11月26日，FDA叫停 健康基因检测服务。2015年3月：批准其布卢姆综合症基因携带者检测服务(一种隐性遗传病)。BRCA1、BRCA2-乳腺癌易感基因，药物靶点（奥拉帕尼）2.肿瘤相关突变基因检测的诊断价值？1）小panel基因突变累积-大panel基因突变累积都在用，那个合适？小panel 2）ARMSPCR法(灵敏度（病理切片/新鲜组织）国外roche，qiagen 5%，国内1%？TKI必要性？NGS（1%随测序深度增加）数字PCR（0.5%）3）ctDNA液态活检 灵敏度应大于1%NGS 数字PCR 应该用更灵敏的方法3.注册审批的难度 1)国家标准物质研制的难点?如EGFR位点很多 2)临床试验的难点 对照试剂?,谢谢！,
