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1、第4章 分子发光分析,分子发光分析法教学要求掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征掌握荧光与分子结构的关系以及溶液荧光强度的影响因素掌握荧光定量测定方法了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的一般结构 了解分子发光分析的应用前景,分子发光,处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。荧光、磷光为光致发光。,第一节 荧光和磷光的基本原理,一、分子荧光和磷光的产生1.分子能级图,基态：电子自旋配对，多重度=2s+1=1，为单重态，以S0表示。,激发单重
2、态：分子吸收能量，电子自旋仍然配对，为单重态，称为激发单重态，以S1，S2表示,激发三重态：分子吸收能量，电子自旋不再配对，为三重态，称为激发三重态，以T1，T2.表示。,三重态能级低于单重态（Hund规则）,单重态与三重态,处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。,单重态与三重态,单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s；而在三重激发态中，两个
3、电子平行自旋，三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 1s以上。,2.分子的去活化过程（去激发过程）（Deactivation）,处于激发态的电子不稳定，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射。,无辐射跃迁,是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR）内部转移（IR）系间跨跃（IX）外转换（EC）等,3荧光,无辐射跃迁方式,（1)振动弛豫 它是指 在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。（2)内转移 当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时
4、，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。图中指出，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。,无辐射跃迁方式,（3）系间跨跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1T1就是一种系间跨跃。通常，发生系间跨跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。（4）外转换 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭”或“猝灭”。,辐射跃迁方式,（1）荧光发射分子电子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级
5、在很短时间跃迁到基态(S0)各振动能层时所产生的光子辐射称为荧光（S1 S0）。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（Stokes效应）。不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为3的荧光。荧光的产生在10-6-10-9s内完成。,辐射跃迁方式,（2）磷光发射 由第一激发单重态的最低振动能级，有可能以系间跨跃方式转至第一激发三重态，再经过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁过程（T1S0）也是自旋禁阻的，其发光速率较慢，约为10-3-10s。因此，这种跃迁所发射的光，在光照停止后，仍可持续一段时间。
6、在低温下才能看到。,荧光与磷光的区别：,荧光是由第一激发单重态最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的；10-6-10-9s S1(0)S0而磷光是由第一激发三重态的最低振动能层至基态各振动能层间跃迁产生的。T1(0)S0 寿命10-3-10s，在光照停止后，仍可持续一段时间。,二、荧光量子效率,荧光量子效率也叫量子产率或荧光效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示,二、荧光量子效率,在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移，系间跨跃和外转换等。很明显，荧光的量子效率，将与上述每一个过程的速率常数有关。,二、荧光量子效率,若用数学式来表达这些关系，得到式中k
7、f为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和。凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。,二、荧光量子效率,实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明ki很小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似。,三、激发光谱曲线和荧光（磷光）光谱曲线,荧光和磷光均为光致发光，有两种特征光谱，激发光谱及发射光谱。1.荧光激发光谱固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线（荧光强
8、度激发波长）。可用于荧光物质的定性鉴别，及定量分析时选择恰当的激发波长。,三、激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线,激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不同的。当然，在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目是最多的，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然能产生最强的荧光。,三、激发光谱曲线和荧光、磷光光谱曲线,2.荧光发射光谱（荧光光谱）如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。可用于荧光物质的定性鉴别，及定量分析时选择恰当的荧光测定波
9、长。,3.同步荧光光谱（自学）,特点：使光谱简化使谱带窄化减小光谱的重叠现象减小散射光的影响,4.三维荧光光谱（自学）,新的荧光技术以荧光强度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图。能提供更完整的光谱信息，可作为光谱指纹技术用于环境检测和法庭试样的判证。,四、荧光光谱的特征,1.斯托克斯（Stokes）位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。,四、荧光光谱的特征,2.镜像对称规则 通常荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称
10、关系。,四、荧光光谱的特征,解释：能层结构相似性 吸收光谱其形状决定于第一电子激发态中各振动能层的分布情况。荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情况。基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布情况是类似的.因此荧光光谱的形状和吸收光谱的形状极为相似。,2.镜像对称规则,吸收,荧光发射,四、荧光光谱的特征,3.荧光发射光谱的形状与激发波长无关因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射光子的速度。故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第
11、一激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。,五、影响荧光强度的因素,分子产生荧光必须具备两个条件：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。影响荧光强度的因素 主要有：分子结构；发光分子所处的环境,五、影响荧光强度的因素,1.分子结构（1）跃迁类型对于大多数荧光物质，首先经历或n激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生或n跃迁而得到荧光。在这两种跃迁类型中，跃迁常能发出较强的荧光（较大的量子产率）。,五、影响荧光强度的因素,（1）跃迁类型 跃迁是产生荧光的主要跃迁类型
12、。这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数（一般比n大100-1000倍），其次，跃迁的寿命约为10-710-9s，比n跃迁的寿命10-510-7s要短。在跃迁过程中，通过系间跨跃至三重态的速率常数也较小，有利于发射荧光。,五、影响荧光强度的因素,（2）共轭效应实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体系化合物除外）。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。例如，在多烯结构中，ph（CH=CH）3 ph和ph（CH=CH）2 ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。例如，苯（0.07）、萘（0.12）、蒽（0.30）。,五、
13、影响荧光强度的因素,（2）共轭效应 共轭效应使荧光增强的原因：主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子，从而有利于荧光的发生。,五、影响荧光强度的因素,（3）取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧光增强。吸电子基团，如-COOH、-NO2、-C O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。,五、影响荧光强度的因素,（3）取代基效应卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间跨越速率增加所致。荧光减弱，磷光增强。如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，
14、荧光逐渐减弱到消失。,五、影响荧光强度的因素,(4)刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。如荧光素（0.92）与酚酞（=0）；芴（1）与联苯（=0.20）；杂氮菲（发荧光）与偶氮苯（无荧光）。（结构见p316）,芴（1）,联苯（=0.20）,杂氮苯（发荧光）,偶氮苯（无荧光）,(4)刚性平面结构,五、影响荧光强度的因素,金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情
15、况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。,(4)刚性平面结构,金属螯合物的荧光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。,(4)刚性平面结构,例如，2，2-二羟基偶氮苯（结构）无荧光,2，2-二羟基偶氮苯与Al3+螯合后（刚性平面结构）有荧光,2.环境因素,（1）溶剂效应溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。,（1）溶剂效应,一般溶剂效应 指的是溶剂的折射率和介电常数的影响。
16、介电常数增加，红移。因为溶剂极性增加，-*红移，能量降低，导致荧光增强。例如，荧光素水介质，=0.65，0.1mol/L NaOH，=0.92因此，荧光分析中，要注意介质的一致性。,（1）溶剂效应,特殊溶剂效应 指的是荧光物质和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作用。一般溶剂效应是普遍的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光物质的化学结构。,（2）温度的影响,温度降低，荧光量子效率和荧光强度将增大。温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。温度过高，可能使荧光物质分解。因此，多数荧光仪利用光阑来减少曝光时间，并使样品绝
17、热。或有温度调节装置。,（3）溶液pH值的影响,带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有所不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就有一定的差别。例如，苯胺,pH 512 蓝色荧光,pH 5 无荧光,pH 12 无荧光,（3）溶液pH值的影响,对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物，一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。例如，邻、邻二羟基偶氮苯与Ga3于pH34形成1：1络合物，产生荧光，但在pH67形成1：2络合物，无荧光。,（4）荧光猝灭,荧光
18、物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。荧光熄灭现象也可利用作为一种测量方法。例如，铝-桑色素配合物的荧光强度因微量F-的存在引起荧光熄灭，溶液的荧光强度与氟离子的浓度成反比。,（4）荧光猝灭,荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和基态的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。,（5）内滤光作用和自吸收现象,溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。,
