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1、,膜片钳技术讲座,2006年12月,第一部分 膜片钳技术的基本概念第二部分 离子通道的基本知识第三部分 全细胞记录结果举例分析,第一部分膜片钳技术的基本概念,学习内容,1.膜片钳的发展历史2.膜片钳的工作原理3.膜片钳记录常用的设备4.膜片钳记录的方式及基本操作5.全细胞记录的步骤6.基本概念和参数的设置,1976年德国马普生物物理化学研究所 Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上记 录到Ach激活的单通道离子电流，从而产 生了膜片钳技术。1980年Sigworth等获得10-100G的高阻 封接（Giga-seal）。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了 改进，引进了全细
2、胞记录技术。,1.膜片钳的发展历史,内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）,合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。二人共获1991年诺贝尔生理学与医学奖。,膜片钳技术（Patch clamp）用微玻管电极接触细胞膜，以吉欧姆（G）以上的阻抗使之封接，使电极开口处的细胞膜与其周围膜在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上离子通道的电流进行监测记录的方法。,Patch clamp 镜下观,Patch clamp 镜下观,2.膜片钳的工作原理,电极拉制器倒置相差显微镜EPC-10膜片钳放大器三维微操纵仪CED 1401数模/模数转换器
3、CED EPC 软件包,3.膜片钳记录的常用设备,电极拉制器：二步法拉制,倒置相差显微镜,EPC-7膜片钳放大器(德国),细胞吸附式（Cell-attached mode 或 on cell mode)内膜向外式(Inside-out mode)外膜向外式(Outside-out mode)全细胞记录方式(Whole-cell recording),4.膜片钳的记录方式及基本操作,微电极的拉制,材料：硼硅酸盐毛细玻璃管 拉制方法：二步法要求：尽可能使头颈部短些（Rs）,拉制好的微电极涂硅酮树酯、热刨光,电极液的充灌:无气泡 充灌玻璃电极长度的1/3,微电极的安装,记录(测量)电极和参考电极：材
4、料是Ag，表面镀成AgCl 减少接触电位,5.全细胞记录,电压钳模式：固定电压，记录电流,电流钳模式：固定电流，记录电压,全细胞记录的操作步骤,制作细胞涂片拉制玻璃电极灌注电极液，安装电极在显微镜下找到微电极，移动三维操纵仪，使电极尖端接触细胞用负压轻轻抽吸，钳紧细胞，形成全细胞记录模式给予一定的钳制电压并观察电流,全细胞记录的形成过程,输入漏电流（Input leakage current）理论上讲，不施加外部命令时，通过放大器探头的电流应该为0，如果由于放大器本身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电流都很小。,6.基本概念及参数设置,封接电流（Seal
5、 current）由于封接质量不高（没有形成良好的高阻封接），从封接处产生的电流。成为噪声。,内向电流（Inward current）从细胞外进入细胞内的正离子（如Na+）电流或从细胞内流向细胞外的负离子（如Cl-）电流。外向电流（Outward current）从细胞内流向细胞外的正离子（如K+）电流或从细胞外流向细胞内的负离子（如Cl-）电流。,Electrode与pipette的区别,Electrode 指金属电极，即Ag/AgCl电极。Pipette 指拉制出的玻璃电极，它不是真正意义上的电极，而是真正电极的依托。,命令电压（Command voltage,Vcmp）通过放大器或计算机
6、发出的指令电压，用于钳制细胞膜电位。钳制电位（Holding potential,Vh）人为地将细胞膜内外的电压差固定在某一数值，这一数值即为钳制电压或称钳制电位。实施这一行为的技术为电压钳技术（Voltage clamp）。,Rs是指流过电极尖端的电流所遇到的所有电阻。当将电极放入浴液中或在形成高阻封接时，Rs主要是电极电阻;全细胞记录模式形成后，Rs包括电极电阻、破裂膜的残余膜片电阻、细胞内部电阻。,一、串联电阻（Series resistance,Rs）补偿,Rs引起的误差有如下二方面：1.串联电阻产生电压降，严重影响膜钳制 电压的数值；2.膜电位对步阶命令电压的反应时间延迟。,补偿方法
7、：调节“%-COMP”按钮,二.液界（接）电位及其补偿 主要成分：1.液体-金属：AgCl电极与电极内液；2.电极内液-细胞外液；3.电极内液-细胞内液（破膜后，等待一 定时间即可消除）。范围：可达几百mV补偿方法：电极入水按“Search”，“Offset”,三.膜片钳系统中的电容,膜电容（Membrane capacitance,Cm）细胞膜的脂质双分子层是电的不良导体，因而由细胞外液-脂质双分子层-细胞内液就构成了细胞膜电容。Cm的大小与细胞膜表面积（包括内陷折叠部分）成正比，与脂质双分子层的厚度成反比。,对于一个球形细胞，膜电容的计算公式为：Cm=d2/100(pF)d为细胞直径（m）
8、,由于有细胞膜内折（Infolding）的存在，实际的Cm要比计算的大1.5-3倍。一般情况下，生物膜的电容大体都是1F/cm2。,电极电容（Pipette capacitance,Cp）电极电容包括跨壁电容（Ct）、电极非浸液部分与邻近地表形成的漂浮电容（Cs）。,跨壁电容（Transmural capacitance,Ct）电极浸液部分的内外液之间形成的电容，跨壁电容的介质为玻璃电极壁。在膜片钳实验中其值可能很大，一般电极浸液深1mm会产生1pF或更大一些的电容。,减小跨壁电容的方法：1.加厚电极管壁：采用厚壁玻璃毛坯拉制电极，或在电极浸液部分外部涂以硅胶树脂等疏水性物质。2.减小电极浸液
9、深度：浸液部分越大，Ct越大。3.补偿电路：采用膜片钳放大器内置的电容补偿电路进行补偿。,慢电容（Slow capacitance,Cslow）与 快电容（Fast capacitance,Cfast）,快电容主要指电极电容；慢电容主要指膜电容。,在贴附式记录时，膜电容数值较小。此时要补偿的电容主要是快电容，即电极电容。打破细胞膜形成全细胞记录模式后，膜电容显著增大。此时主要补偿的 是慢电容，即膜电容。,电容补偿的原则,C-FAST和-FAST按钮“Fast”钮补偿快电容，主要是电极电容。大部分的电容瞬变值可用“Fast”控制钮进行补偿。,四.快速电容补偿（fast capacitance c
10、ompensation）,“C-Slow”钮补偿慢电容，即电极尖端与大地之间的电容，主要是膜片电容。在全细胞记录模式，缓慢电容补偿的值即为该细胞的电容值。,五.缓慢电容补偿（slow capacitative compensation）,第二部分电压门控性离子通道基本知识,电流密度（Current density）单位细胞膜面积的电流大小。在进行全细胞记录时，由于细胞直径大小的不同，离子通道数目也不相同，因此为便于不同细胞间的比较，采用电流密度这一概念。由于膜电容的大小与细胞大小成正比，故 电流密度=Im/Cm(pA/pF),整流（Rectification）整流是指电流易向一个方向流动，而不
11、易向反方向流动。内向性整流是指正离子易从膜外向膜内流动，而不易从膜内流向膜外。,原因：离子通道的开放导致膜电阻发生了 变化。表现：电流和电压的关系不满足欧姆定律 的直线关系。,外向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠近。如IK电流。内向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠近。如烟碱电流。,IK电流的外向整流,烟碱电流的内向整流,去极化方向,去极化方向,尾电流（Tail current）指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录到的电流称为尾电流（Tail current）。,电流的Rundown现象 指随着记录时间的延续，通道电流逐渐降低的现象。许多种类细胞
12、的钙电流都具有Rundown现象。,Rundown现象形成的原因 全细胞记录模式形成以后，由于电极内液与细胞内液之间的相互透析，造成细胞内大分子物质稀释或丢失；同时，细胞内ATP也因稀释而严重不足，而钙离子在外排时耗能较大，从而导致Rundown现象的发生。,减小电流Rundown的方法：1.电极内充灌ATP、GTP等可减弱其发生速率。2.采用穿孔式膜片钳记录方法（Perforated patch clamp），由于其只在细胞膜上用药物形成微小孔洞而不打破细胞膜，所以细胞内大分子成分和ATP均不会被稀释或丢失，能够有效地抑制Rundown现象的发生。,第三部分全细胞记录结果举例,附录1.推荐书目王绍,徐涛.电生理学方法.韩济生主编.神经科学原理.第二版.pp55-65.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.张均田主编.现代药理学实验方法.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997.陈军.膜片钳实验技术.北京:科学出版社,2001.刘振伟.脑片膜片钳技术及其研究概况.张均田主编.神经药理学研究进展.pp137-150.北京：人民卫生出版社，2002.,测试题：,1.膜片钳的主要记录方式有哪几种，各 有何优缺点?2.什么叫整流，产生整流的原因是什么？,
