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1、第1章色谱分离原理Chromatography Principle,教学目的和要求1、了解色谱过程和分类；2、掌握色谱保留值的表达和计算（比移值、容量因子、保留时间、保留因子、容量因子等）；3、了解气相、液相色谱保留值规律、速率理论；4、掌握分离度的含义及计算方法。,基本知识点各种色谱方法；色谱的定性定量依据；谱带展宽原因；分离度；分离度与色谱特性的关系；色谱条件优化,1.1 概 述,色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromat
2、ography)。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，发明分配色谱（1952年获诺贝尔化学奖）。1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。20世纪50年代气液色谱的创立和发展具有划时代的意义，催生了许多现代色谱方法。,1.2 色谱过程及其分类,色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移
3、动而达到分离的目的。,色谱分离,色谱分类,图61 色谱分类,气相色谱法,1.3 区带迁移,迁移是色谱系统中不可缺少的组成部分。通常，柱色谱实验都是把样品从色谱柱的一端引入，而在另一端检测从柱中流出的流动相。有三种基本方式可实现柱色谱的选择性区带迁移：洗脱法（elution）、置换法（displacement）和前沿法（frontal analysis）。,柱色谱的区带迁移模式,1.4 色谱保留值,1.4.1 基本关系比移值（rate of flow）:,Rf 值主要用于描述平面色谱的保留行为，是色谱定性的依据。Rf=0，溶质留在固定相不动，谱带不移动，ux=0 Rf=1，溶质全部在流动相，ux
4、=u,分布系数 K（distribution coefficient）:当溶质在两相中达到分布平衡时，溶质在固定相和流动相中的浓度比值称为分布系数。,分配色谱：K分配系数吸附色谱：吸附平衡常数,容量因子 k（capacity factor）或容量比（capacity ratio）:当溶质在两相中达到分布平衡时，溶质在固定相和流动相中的量（质量、摩尔数）的比值。,色谱保留时间（retention time）tR、流速（flow rate）u和保留体积（retention volume）VR的关系:VR=u tR,搞清楚：死体积V0、死时间t0、调整保留时间tR、调整保留体积VR的概念！,1.4.
5、2 分子间的相互作用能色谱分离中的一个重要的热力学参数是容量因子k，其大小在热力学上取决于分配系数K，而K的大小又取决于溶质分子在两相间的相互作用能。相互作用能有多种形式：色散能、诱导能、取向能、电荷间相互作用能以及氢键等。分子间的相互作用能的一般表达式:,式中，B1 B4为系数；A、A、H和0分别为溶质分子的极化率、偶极矩、氢键和其他作用能。,1.4.3 气相色谱保留规律,气固色谱：,lnk 1/T的关系曲线称为Vanst Hoff曲线,何谓反相液相色谱？以键合C18或C8为固定相，以水作为弱洗脱剂。以甲醇、乙腈和四氢呋喃等有机溶剂为强洗脱剂，通过水和有机溶剂不同配比形成不同洗脱强度的流动相
6、。在二元溶剂（甲醇+水）的反相色谱中，保留值方程：,Must operate in high pressureUsually constructed of metalsTypical dimensions10-30 cm long1-3 cm IDContains packing material which holds the stationary phaseMany types existTypical packing materials are 5-10 m in diameterGuard column used to extend life of main column,HPLC C
7、olumn,1.5 谱带展宽,6.5.1 6.5.6自学内容,1.6 分离度 resolution,定量描述相邻两组份在色谱柱内分离情况的指标。,当色谱峰底宽交叠不易测量时，可以采用半高峰宽来代替峰底宽计算分离度，称为半高峰宽分离度R1/2。,t1/2=W1/2,峰高分离度Rh：两个不等高的色谱峰的分离度。如何求算？,1.6.1 分离度与色谱柱特性,色谱分离中常称两相邻色谱峰的组分为“物质对”，混合物分离条件的选择主要是提高最难分离物质对的分离度。根据W=4tR/(N)1/2，当两相邻组分保留值相近时，可以认为两者具有相同的N值，分离度R可表示为：,R与各种参数关系的通用方程,当色谱保留值较大
8、，相邻色谱峰底宽相近时，则分离度近似表示为：,当 t 值较大时，则这种近似表示误差较大，将N=L/H 代入上式，得到：,结论：分离度是物质对相对保留、分配容量k 和色谱柱效N（或H）的函数。,图6-10 影响分离度的因素示意图,搞清各项的物理意义,1.7 分离时间分离时间指物质对中第二个峰洗脱出来所需的时间，即tR2。对于多组分混合物，分离时间为最后一个组分的保留时间。,希望搞清各项物理意义！,亲和色谱(Affinity chromatography),1.Substrate analogue affinity chromatography,+,Affinity ligand,Enzyme,M
9、atrix Spacer arm,Active-site-bound enzyme,2.Immunoaffinity chromatography,Matrix Spacer arm,Antibody ligand,+,Protein epitope,Antibody-bound enzyme,超临界流体介绍,什么是超临界流体达到或超过临界压力和临界温度的任何流体超临界流体结合了气体和液体的特点，是理想的溶剂替代品二氧化碳最适合用于超临界流体（超临界点：31.3，7.38MPa）超临界流体的主要技术领域 超临界色谱（SFC）超临界萃取（SFE）超临界结晶主要应用领域制药精细化工,扩散速度更快线
10、速度更高复平衡速度更快更高的通量粘度更低压力降更小流速更高可实现多柱序列分离溶剂极性变化非线性有机改性剂的加入可以极大的改变流体的极性SFC为正相分离与传统液相相比，产生废弃的有机溶剂更少,SFC技术特点,SFC对比HPLC的优势,分离三角形,分析速度,分辨率,灵敏度,在保证分辨率和灵敏度的情况下获得更快的分析速度,分离度公式,选择性、柱效和容量对分离度的影响,选择性与颗粒大小无关,柱效,通常用一下方式表示：理论塔板数：N每米理论塔板数：N/m理论塔板高度：H=L/NH越小，色谱柱柱效越高。,范第姆特曲线（Van Deemter Curve）理论塔板高度与流速的关系,相同的流速，SFC的柱效比
11、HPLC高三倍相同的柱效，SFC的线速度比HPLC高四倍,颗粒度越小，增加线速度时牺牲的柱效越少。当SFC使用3um的色谱柱时，柱效基本无损失。,范第姆特曲线（Van Deemter Curve）理论塔板高度与流速的关系,范第姆特曲线最优流速经验公式,Dm为扩散率，dp为粒径提高最优流速只有两条路，一条为增加扩散率，一条为减小粒径,范第姆特曲线最优流速经验公式,最优流速：,保留时间：,分离效率：,高扩散率(DM)意味着更高的流速，分离相同数目的峰所需的时间更少。,相同的柱长，SFC分析速度比HPLC快3-10倍;如果相同的分析时间，SFC可以使用3-10倍柱长的色谱柱，理论塔板数也高3-10倍
12、。,压力降公式,压力降简化经验公式,压力降简化经验公式：,分离效率：,使用HPLC，由于压力降的限制（柱长的增加和粒径的减小都会增加压力降），很难提高塔板数。,使用SFC，由于低粘度、低柱压降，所以能高得到更高的流速，更长的柱长，甚至是串联色谱柱来得到极高的分辨率。,SFC是一种超快速色谱(I):手性分离,对映异构体的外消旋混合物,非对映异构体混合物,SFC是一种超快速色谱(II):非手性分离,超快速 SFC(10 ml/min)结合超快速TOF质谱(0.1 sec/spectrum).样品分析时间为 40 s.,Bolanos,Ventura,Greig et al.,J.Comb.Chem.5,451-455,2003,SFC在制药和天然产品分析中的应用,天然产物：棕榈,SFC 用于分离植物中的营养物质,生物柴油分析,SFC可用于分离生物柴油中的脂肪酸甲酯、游离脂肪酸和甘油。,除草剂和农药,Metolachlor,Questions for you？,本 章 结 束,
