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1、世和基因内部培训材料 NGS与其他检测序技术流程的对比2016年7月,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,临床常用诊断技术,2,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,肿瘤诊断方法,影像学诊断：超声，CT，MRI，PET，PET-CT组织细胞形态学诊断：-HE染色-辨别肿瘤细胞及分型免疫组化诊断：-利用抗原抗体结合反应原理-针对蛋白类肿瘤标记物（癌胚抗原，糖类抗原，甲胎蛋白等）的检测-鉴别组织来源分子诊断：-荧光原位杂交（FISH）
2、、基因探针及标记、多聚酶链式反应（PCR）、DNA序列分析（sanger测序、ARMS法、二代测序）等-针对肿瘤的癌基因/抑癌基因、生长因子及受体,以及肿瘤相关的某些染色体 位点异常的检测,3,组织病理学检查仍是癌症诊断的“金标准”,4,FISH,ARMS,肿瘤,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,点击添加文本,肿瘤病理诊断治疗已进入个体化分子时代,免疫组化,一代测序,数字PCR,二代测序,检测方法的介绍,免疫组化（IHC）荧光原位杂交（FISH）桑格测序（Sanger测序法）扩增阻滞突变（ARMS）-PCR法数字PCR（ddPCR）二代测序,6,Copyright 2013.GENES
3、EEQ Technology Inc.All rights reserved.,检测方法介绍,免疫组化染色,7,原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。,免疫组化是从蛋白层面看问题的，与测序不同，一个是因（DNA），一个是果（Protein
4、），所以体内出现一些未知突变，如果对蛋白功能产生影响，也是可以看出来的。,0分,1分,2分,3分,荧光原位杂交（FISH）,定义：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反
5、应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。分析,9,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,荧光原位杂交(FISH)检测以HER2为例,FISH检测乳腺癌细胞HER2扩增代表性图例,高倍扩增,无扩增,扩增,无扩增,DNA序列测定的意义,DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的详细了解。,桑格测序原理,原理：利用DN
6、A聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，合成链序列，由此推知待测模板链的序列。,13,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,Sanger测序的流程,结果解读,扩增阻碍突变系统(ARMS)-又称等位基因特异性扩增（ASA），利用PCR引物的3 端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩
7、增引物。ARMS（ASA）的特点是：“只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增”优势灵敏度高，重复性好，对标本突变率要求底操作简单，仪器费用较低廉检测时间短不足仅能检测已知突变类型不能得到具体碱基突变类型,ARMS法检测,16,数字微滴PCR(ddPCR),通过将微量样品扩大倍数稀释和分液(partitioning)，直至每个样品中所含有的待测分子数不会超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，并对发生了扩增反应的样品逐个进行计数的一种技术。,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,
8、ddPCR的工作流程,原理是在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP。通过碱基互补配对原则逐一的添加标记过的dNTP，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机识别、转换，从而生成相应的序列信息。,18,新一代高通量测序(NGS)的原理,四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多数使用Hiseq平台,新一代高通量测序(NGS)能同时检测不同形式的基因突变,Marc Ladanyi.2015 ASCO Annual Meeting,19,检测方法比较
9、,20,Copyright 2013.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,各种方法检测的对比,21,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,总结Summary,22,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,NGS只需要微量样本就可以一次性检测所有的突变类型,FISH做扩增与融合对实验室研判人员的要求较高，NGS通过优化算法，降低人工出错的比率。,阴性对照极为重要，具有质控和探查种系突
10、变的作用,ARMS,ddPCR等传统一代测序方法在热点测序这一块的确精准度较高，但是本质上仍旧是热点测序，不能满足越来越大的检测需求,世和专有探针库保证了前期提取的DNA质量,NGS&ctDNA 技术优势,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,NGS技术特点及优势,检测全面,精准度高,周期短,样本需求少,全自动化的大数据分析方法,时时更新的医学数据库,高通量,单次检测中同时发现多个基因的多种突变 包括单碱基突变、碱基缺失、碱基插入和基因融合,单次反应只能针对一种突变进行检测，并只能检测一种突变类型,同时对416个
11、致癌基因 进行测序展现所有突变,每次反应只检测单个基因一种突变,世和的技术在单次检测中对每个碱基覆盖600次以上，杜绝假阳/阴性结果,技术局限，假阳/阴性错误率高,只需一次微量 肿瘤样本，并且可以检测手术样本，血液/积液样本，FFPE石蜡样本等,多次检测导致样本量大、价格高、耗时长,实现数据分析的算法优化和分析自动化，快速处理海量病人数据，杜绝人为错误,技术局限无法及时有效处理海量病人数据,以FDA逾三万份临床数据为基础，报告切实有用，有效帮助医生和病人选择高敏感性的药物,不同实验室的各种报告而造成的信息重复或混乱，无法保证临床数据库的完善性和时效性,检测流程高度自动化，7天 提供全面准确报告
12、,多次反复测试，造成耗时长，而且由于技术局限无法提供全面的报告,上一代传统基因检测,高通量测序,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,NGS与液体活检结合可有效解决传统检测面临的挑战,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,ctDNA液体活检特点和优势,26,克服肿瘤异质性与组织高度匹配取样无创简便动态监测药物疗效动态监测耐药情况有效评估预后,Nat Rev Clin Oncol.2013 Aug;10(8):472-84.,没有组织
13、怎么办？,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,初始诊断性活检是通过组织病理学、免疫组化和分子学特征描绘进行评估的，根据结果制订治疗方案在获得性耐药时进行再活检，并采用同样的方法重新分析以发现耐药时收集的标本与治疗前标本的差异该过程在各治疗阶段时重复进行应形成可能的细胞株和患者衍生的移植瘤模型以促进耐药机制和治疗作用的功能性研究,Politi K,et al.Clin Cancer Res.2015 May 15;21(10):2213-20.,分子学特征和再活检与癌症治疗的整合,27,检测全面克服肿瘤异质性,肿
14、瘤具有复杂的时空异质性不同位置具有不同病灶肿瘤亚克隆,Andriy Marusyk,et al.Nature Review Cancer.2012.,Almendro V,et al.Annual review of pathology 2013.,由于组织检测只取样于肿瘤的某一部位，无法衡量肿瘤组织的异质性，导致检测信息不全面。ctDNA：由于ctDNA来源于患者体内不同位置的肿瘤细胞，同时经过人体天然血液循环系统混匀，其携带的肿瘤基因信息更全面，规避了肿瘤组织的异质性。,灵敏度高准确度高假阳性率低,Zheng et al.Sci Rep6:20913(2016).,Thierry et a
15、l.Nat Med.2014;20(4):319-449.,为什么要进行ctDNA基因检测,现有的基于血清蛋白生物标记物（例如CA-125和PSA）的无创检测方法存在一定数量的假阳性与假阴性结果，并不能对肿瘤的进展做出准确判断,ctDNA可从血液中较易分离（liquid biopsy），并携带肿瘤特异性的体细胞突变，因此极为适合作为肿瘤无创诊断及监测的生物标记物,对ctDNA进行基因检测还可以及时发现肿瘤复发后产生的抗药性突变，而及时对治疗方案进行调整,尽管肿瘤本身是肿瘤DNA的最直接来源，但是通过活检或手术获取肿瘤组织是侵入性的，具有一定风险的。而且有些癌症病人不宜进行手术，无法获得肿瘤组织
16、进行基因检测，以帮助制定治疗方案,30,ctDNA检测中遇到的问题及挑战,ctDNA总量取决于：样品提供人的健康状态取血及保存运输血液/血浆样品的条件血浆的制备方法DNA的提取方法以及DNA的定量方法,31,Copyright 2015.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,世和基因的技术优势：大幅提高ctDNA回收率从微量ctDNA建立测序文库,ctDNA在血液中含量极少，片段较小，提取方法及其重要,1,建库及富集的产量,2,事实上，ctDNA检测的核心在于前期准备以确保ctDNA文库的多样性，保证被检测样本有代表性是下游测序及分析的基石,
17、32,那么多公司，为什么选择我们？世和的优势,世和的优势来自于步步优化，精益求精,33,世和的优势来自于步步优化，精益求精,34,优势在于每步优化！,QC步骤,样本收集两小时之内分离血浆,35,收到血样后2小时内分离血浆血浆多种运输条件实验室模拟不能输在起跑线上！,运输全血至总部再分离血浆季节地域温差大，影响质量直接影响检出率,世和基因,其他公司,Sci Transl Med.Aug 26,2015;7(302):302ra133,2小时内收集血浆是临床试验、高分论文金标准！,分离全血收集血浆，时间精至分钟！,DNA提取I血浆ctDNA富集小片段ctDNA，去除干扰,36,小片段含肿瘤特异突变
18、,大片段不含肿瘤特异突变,血浆DNA经过大小片段分离有效富集小片段ctDNA！更丰富的起始原料,世和基因数据,DNA提取II石蜡组织自主研发基于qPCR的样本质控,37,0.5,率先使用荧光定量PCR法用于FFPE样本质控自主设计引物，经过8个参数计算模型，确保通过QC样本测序质量避免交联过于严重的石蜡样本进入流程,测序质量好,测序质量差,世和基因数据，基于100例临床病人石蜡样本测序结果,样本建库不计成本的大量进口试剂优化,38,上百种进口试剂反复搭配优化极大提升建库效率,39,靶向富集I基因捕获探针Mass spec质控单独合成,基因靶向富集15000余个探针探针库反复优化14次，历时3年
19、，保证每个基因每个外显子覆盖探针单个合成，Mass Spec保证质量7项核心专利,芯片合成探针的缺点：大规模一次合成多个探针统一剪切探针的完整性等品质无任何保证大部分探针都不完整，导致基因捕获效率大大降低,芯片合成探针的缺点,反复15000次,40,靶向富集II为什么一定要“好”探针？,什么是探针的均一性（Uniformity）？,探针覆盖不均一,探针覆盖均一,ALK19内含子,测序数据的重要参数，除了测序深度，还有探针均一程度换句话说，如果EGFR覆盖3000X，而ALK只覆盖300X，将会严重影响检测敏感性检测灵敏度是由覆盖最低的基因决定的如不均一，等于没测！,41,世和基因Illumin
20、aHiseq4000/Miseq,其他测序公司IlluminaNextseq500,四色荧光判别ATCG四种碱基 激光超高分辨率照相机 Miseq为首个FDA批准临床的 高通量测序仪 国际NGS高分文章，绝大多数使用Hiseq平台,二色荧光判别ATCG LED照相机 准确率和灵敏度较差 主要用于产前检测,上样测序Illumina Hiseq4000/Miseq与国际接轨,42,数据分析报告生成I生信分析和突变分析的完美结合,生信分析各类型突变,反复研讨数据库比对,最终突变列表,A,B,C,报告止于”一键生成”？,报告初稿,审核,报告终稿,终审/打印/发送,协助医生进行临床突变研判,基本信息 突
21、变解读,突变初筛A,突变初筛B,突变初筛C,近40人临床突变分析团队,43,数据分析报告生成II为什么不能“一键出报告”？,临床测序数据涉及到病人用药方案需要人工排除假突变需要人工验证真突变除常见突变外需要查找文献MD Anderson、Foundation Medicine等国际领先的中心机构，突变全部需要人工核查！,“假突变”：RB1基因16内含子重复区域,低丰度突变：1%的EGFR T790M,PTEN基因5外显子C124S突变，是PTEN磷酸酶催化结构域内的活性位点，在脱磷酸化过程中，C124位点在攻击底物的磷酸基团，并形成一个硫代磷酸酯中间体。有研究表明，PTEN C124SA突变可
22、导致PTEN蛋白的脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶的双失活，进而可能激活PI3K/AKT信号通路,罕见失活突变：PTEN C124S,44,数据分析报告生成III突变研判，分层报道,NCCN/FDA/CFDA涵盖基因突变能够直接指导用药或提供预后信息,在其他癌种已获NCCN/FDA/CFDA批准及本癌种II/III期临床试验中相关突变,临床前研究数据中涵盖基因突变不能直接用来指导用药和预后,Class I,目前突变意义不明,Class II,Class III,Class IV,45,Copyright 2016.GENESEEQ Technology Inc.All rights reserved.,谢谢！,
