《干细胞工程.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《干细胞工程.ppt（97页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、1,Stem cell engineering,第九章干细胞工程,2,9.1 概述9.2 干细胞体外培养技术9.3 干细胞治疗及临床应用9.4 干细胞工程展望,本章内容,3,利用干细胞工程技术有可能实现：完美地修复或替代人体组织、肢体或器官的伤残根治恶性肿瘤、帕金森病、中风等疾病,9.1 概述,4,1、干细胞的概念,干细胞（Stem Cell，SC）是来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞,同时还能分化为祖细胞。,通俗地讲，干细胞是尚未发育成熟的细胞，它具有再生为各种组织
2、、器官的潜能，医学界称其为“万用细胞”。,9.1.1 干细胞,5,按分化潜能分类,全能干细胞,多功能干细胞,单功能干细胞,具有形成完整个体的分化潜能。例：胚胎干细胞可无限增殖分化为全身200多种细胞类型形成机体的所有组织、器官,具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力例：骨髓多能造血干细胞可分化出至少12种血细胞,只能向单一方向分化，产生一种类型的细胞。例：肌肉中的成肌干细胞,2、干细胞的分类,6,按发生学来源分类,胚胎干细胞,成体干细胞,正常情况下处于休眠状态，在病理状态或外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新的能力。,7,1）形态和生化特征,3、干细胞的特性,动物细胞
3、模式图,8,形态：细胞体积较小，通常呈圆形或椭圆形，核质比例较大。细胞核染色质分布较弥散，核仁较明显。细胞质内除含有游离核糖体外，其它细胞器均少且小。根据形态学特性和存在的位置可以辨认不同的干细胞。,9,生化特征：不同种类的干细胞生化特征有所差异，都有较高的端粒酶活性，具有较强的增值能力。不同干细胞具有各异的生化标志。实验证明，干细胞生存的微环境可以影响其形 态和生化特征。,10,2）增殖干细胞的增殖方式 干细胞通过两种有丝分裂方式进行繁殖：,11,有丝分裂周期,G0期：休眠期G1期：DNA合 成前期S 期：DNA合 成期G2期:DNA合 成后期M 期：有丝分 裂期,12,有丝分裂,13,2）
4、增殖干细胞的增殖方式干细胞通过两种有丝分裂方式进行繁殖：,对称分裂两个相同的（干/分化）细胞非对称分裂 一个干细胞 一个祖细胞分化细胞成熟细胞,14,干细胞的增殖特征缓慢性：干细胞的增值速率一般比较慢。机体需要时可以进入分化过程，以适应组织器官生长、发育和修复的需要。进入分化期后，其增值速率开始逐渐加快。意义:有利于干细胞对特定的外界信息作出反应，以决定其是 进行增殖或是进入特定的分化程序。可以减少基因发生突变的危险，使其有更多时间发现和 校正复制错误。,15,自稳定性：干细胞可以在生物个体生命中的自我更新并维持其 自身数目恒定。为了保持干细胞数目的恒定，机体需要对干细胞的(对称或不对称)分裂
5、进行十分精确的调控。意义:可以使得机体对干细胞的调控更具有灵活性，进而 灵敏地应对机体生理变化的需要。,16,3）特点,属终末分化细胞,终生保持未分化或低分化 特征,缺乏分化标记。在机体的数目、位置相对恒定。具有自我更新能力。能无限地分裂、增殖，可连续地分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。,17,具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组 织细胞。同时也具有分化发育的“可塑性”。分裂的慢周期性，绝大多数干细胞处于G0期。,18,（1）体细胞 动植物体内任何生殖细胞以外的细胞都可以称为体细胞。（2）体细胞核移植 将体细胞的细胞核移入一个成熟的去核卵母细胞的过程。,相关名词解释,19,区别,干
6、细胞分裂产生 两个子代细胞,祖细胞分裂产生 两个子代细胞,至少一个为干细胞,另一个为干细胞或分化 细胞,两个祖细胞或两个分化细胞,(3)祖细胞 胚胎和成体组织中的祖细胞是部分特 化的，它可以分裂并产生某种类型的细胞。,20,（4）细胞分化 是指一个或一种细胞，其分裂增殖的后代细胞，在形态、结构和功能上相互间不同并与亲代细胞也不同的过程。,21,（5）可塑性与横向分化 成体干细胞不仅可以生成它们所在组织的成熟细胞,而且在特定环境下能分化成其他组织类型细胞,实现跨系统，甚至跨胚层的分化，干细胞具有的这种特性称为可塑性。而这种分化的现象被称为横向分化或转分化。（例：神经干细胞，可分化为血液细胞）,2
7、2,(6)组织工程 就是利用细胞培养技术在体外人工控 制细胞分化、增殖并生长成需要的组织，使之 工程化批量产出，用来修补由于意外损伤等引 起的功能丧失的体内组织，满足临床康复的需 要，并有可能对一些尚无法根治的疾病提供方 案。（如：恶性肿瘤、帕金森病、中风）,干细胞工程属组织工程的上游研究技术,23,1896年，E.B.Wilson首次使用干细胞名词 1961年Till和McCulloch首先描述了造血干细胞 的特征 1967年，美国华盛顿大学的多纳尔托马斯开拓了 干细胞临床应用的研究 1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman建立 了胚胎干细胞系,9.1.2 干细胞研究的进展,24
8、,1998年11月，美国威斯康星大学的Thomson和 Shamblott成功地使人类胚胎干细胞在体外生 长和增殖 1999年3月，美国科学家Goodell发现小鼠肌肉 组织干细胞可以横向分化为成血细胞。2001年11月25日，美国马萨诸塞州先进细胞技 术公司培育出人体早期胚胎,25,2002年2月，麻省理工学院科学家首次用人体ES细胞培育出毛细血管随后的35年期间，各国的科学家们进一步致力于诱导胚胎干细胞分化、成体干细胞的“横向分化”方面的课题,26,目前，科学家已经试图将一些正常的体细胞直接转化为诱导多能性干细胞（iPCs），它们具有类似胚胎干细胞（ES）的功能。2007.11.20日本京
9、都大学Yamanaka和美国威斯康辛大学JamesThomson，宣布成功把人体皮肤细胞改造成类似胚胎干细胞的“万能细胞”。,27,9.1.3 干细胞工程的重要性及意义,重要性1999年12月美国科学公布干细胞研究的新发现荣登“世界十大科学成果”之首2000年再入选科学评选“世界十大科学成果”2001年末科学将干细胞研究列为2002年六大热门科技领域榜首。,28,2003年自然科学分别将老鼠的胚胎干细胞中产生出精、卵细胞列为十大科学进展第4和第7位。2007年自然和科学将将体细胞“返老还童”变成胚胎干细胞的研究结果，分别列为当年十大重要发现之一时代杂志甚至将上述实验结果列为2007年重大发现之
10、首!,29,意义,组织、器官移植的新来源：研究发现，取自胚胎或骨髓的干细胞可用于培养不同的人体细胞、组织或器官，这有望成为移植器官的新来源。攻克某些重大疾病的根本措施 组织、器官移植可望成为2l世纪人类攻克某些重大疾病，如心脑血管疾病、癌症、老年性疾病等的根本措施。,30,重建或修复组织器官的种子细胞 已有临床实验证明，干细胞是重建或修复病损或衰老组织器官功能的理想种子细胞,对白血病、癌症、严重免疫性疾病以及心血管疾病、糖尿病、早老性痴呆症和脊髓受损患者有惊人的治愈作用。,31,认识基本生命规律干细胞研究将促进科学家重新认识细胞生长、分化、生物发育机制等基本生命规律；尤其是胚胎干细胞的识别、分
11、离、增殖、定向分化将成为细胞生物学以及整个生命科学的主攻热点。,后基因组计划的关键部分之一 在人类基因组框架完成之后，细胞工程或称组织工程，尤其是干细胞的研究将成为后基因组计划(post genome project)的极为关键部分之一。,32,1、单细胞悬液的制备将干细胞所在的动物组织材料制备成单细胞悬液。,组织的提取 确定所需要的干细胞在机体中存在的部位，并取得这个部位的组织，这样即可获得目的干细胞同时又可达到初步富集的作用。,9.2干细胞体外培养技术9.2.1 干细胞的培养过程,33,细胞悬液的制备,吸管、针头吹打 组织研磨器研磨不锈钢或尼龙网搓洗,胰蛋白酶消化螯合剂处理不含Ca2+、M
12、g2+的缓冲溶液泡,机械分离：,酶法解离：,34,细胞分离 指将组织材料分散制成细胞悬液 后，从中获取目的细胞的过程。,细胞纯化 从原代培养成分混杂的异质性细胞悬液 中或者从培养物中获得单一类型的细胞 的过程。,2、干细胞的分离纯化,35,细胞系（细胞株）通过细胞分离和纯化过程，使 得培养物成为单一型培养物，甚至是遗 传特性完全一致的培养物，称为细胞系。,36,主要是根据不同细胞所具有的各自特性来实现物理特性 密度、体积、电荷等化学特性 特异性表面标志和功能,分离纯化的原理,37,利用细胞体积和密度 沉降作用,选择性的细胞凝集 加速沉降,基于不同黏附特性 贴壁生长能力,利用细胞表面标志 单克隆
13、抗体的特异性和 多样性,分离纯化的方法,38,液氮保藏法原理：细胞在-130下代谢作用停止。液氮的温度可达-196，可使细胞的代谢活动停止，化学作用消失。保护剂：防止细胞破裂 甘油 二甲基亚砜(DMSO),3、干细胞的冻存与复苏,39,冻存复苏方法,冻存：细胞悬液+保护剂缓降温1/min，至-25再置-70-80低温冰箱,过夜-196液氮长期保存。,复苏：直接取出冻存管（-196）立即置37水浴12 min内融化倒入含培养液离心管洗涤去除保护剂细胞转入培养瓶中培养。,40,干细胞的体外培养 即将上述从机体的组织中分离纯化得到的单个干细胞，给予必要的生长条件，模拟动物体内生长环境，使其在体外继续
14、生长和繁殖。,9.2.2 干细胞的体外培养条件,41,（1）营养要求：氨基酸、碳水化合物、维生素及一些无机离子、生长因子等。,（2）环境条件：,温度：哺乳动物细胞适宜的体外培养温度为3537，一般控制370.1。,体外培养条件,42,渗透压：多数细胞有一定的耐受渗透压能力，可在培养基配制时加以控制。,气相：需要有氧条件，氧分压维持略低于大气状态，此外，还需CO2。,pH：各种细胞对pH要求不尽相同，多数细胞pH 7.27.6间生长良好。,环境无毒和无菌：对培养用的容器清洗和消毒，对培养基除菌及灭菌。以防止真菌、细菌及支原体的污染。,43,1、基本方法,悬滴培养法培养瓶培养法 旋转管培养法 灌注
15、小室培养法 培养板培养法,9.2.3干细胞培养的基本方法及体外培养类型,44,悬浮培养 指细胞在培养皿中自由悬浮生长的过程。用于非贴壁依赖型细胞。贴壁培养 必须黏附在固体介质表面上生长的细胞培养。固定化培养（微载体培养系统）即适用于贴壁依赖型细胞,又适用于非贴壁型依赖性细胞的包埋培养方式。,2、体外培养类型,45,46,1、何谓造血干细胞（HSC）,血液中血细胞,淋巴系细胞,髓系血细胞,B淋巴细胞 T淋巴细胞,单核巨噬细胞粒细胞巨核细胞红细胞,9.3 干细胞治疗及临床应用9.3.1 造血干细胞,47,一个成年人含有 2.51013个红细胞每一个红细胞平均寿命为 120天（107秒）相当于机体每
16、秒需产生 2.5106个红细胞这些成熟的血细胞是如何产生？,48,所有血细胞均来自于一个共同的始祖细胞 造血干细胞（HSC）即：造血干细胞造血祖细胞前体细胞 成熟血细胞,造血干细胞定义 是一小群具有高度的自我复制和多向分化潜能的最原始的造血细胞。,49,（1）在体内终身生存，数量和质量保持不变，移植后可永久重建造血；（2）兼有向髓系和淋巴系多向分化的潜能，即重建造血的同时重建免疫。,造血干细胞的功能,50,一个造血干细胞 分裂为两个子细胞,一个自我更新保持机体内干细胞数量相对稳定,另一个多向分化成熟血细胞直至衰老死亡,造血干细胞采用不对称的分裂方式,造血干细胞的分裂方式,51,骨髓外周血脐带血
17、胎儿造血系统胚胎干细胞和胚胎生殖细胞,造血干细胞的来源,52,血液系统病实体癌免疫缺陷性疾病遗传性疾病自身免疫性疾病等的支持治疗免疫治疗替代疗法基因治疗,2、造血干细胞的临床应用,53,表1 造血干细胞移植适应症,54,血癌包括：急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血 病、慢性髓细胞白血病、何杰金病、多发性骨髓瘤和非何杰金淋巴瘤。,传统的治疗方法：,放疗、化疗 杀伤正常骨髓细胞骨髓移植 来源受限,（1）治疗白血病和淋巴瘤,55,(自体)干细胞移植法,先用大剂量的放、化疗将骨髓中癌变造血细胞摧毁取病人本身少量的正常的干细胞在体外大量扩增再将其移植至病人骨髓中正常的干细胞在病人体内自我更新并且分化出各
18、种所需的正常血细胞病人完全康复！,56,用于造血干细胞移植的干细胞来源：骨髓 HSC的主要存在部位 最初来源外周血 目前动员的外周血已逐渐代替骨髓脐带血 第三种造血干细胞的来源,57,遗传性血液病包括：各种遗传性贫血（不能生成红细胞），先天性代谢失调（关键酶缺失），如：再生障碍性贫血、-地中海贫血、骨髓石化症等。利用干细胞移植法：（1）异基因HSC移植 免疫排斥（2）自体HSC的遗传修饰 补充缺陷基因的功能,（2）治疗遗传性血友病,58,放、化疗的目的在于杀灭快速增殖的癌细胞，但同时也杀灭了快速增殖的正常HSC。,利用干细胞移植法：（1）自体干细胞骨髓移植以补充被杀灭的HSC；,（2）从放、化
19、疗前动员的外周血中采集HSC并储存，化疗后将这些细胞重新注入该病人体内。,（3）癌症放、化疗后造血干细胞的恢复,59,需注意！体外分离纯化HSC：该法虽无免疫排斥问题，但有可能会收集一些癌细胞，需首先在体外分离纯化HSC以便去除癌细胞，再将纯化的HSC重新注入病人体内。,60,实体瘤包括：肺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、食管癌、肝癌、胰腺癌和乳腺癌。利用干细胞移植法：,采用异体干细胞移植也称为“细胞疗法”,攻击一些无法治疗的肿瘤。(使免疫系统恢复),已发现：脐带血和外周血采集的HSC（在试管中）具有抗白血病和乳腺癌的肿瘤的作用。,（4）治疗实体瘤,61,AD包括：溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、
20、系统性红斑狼疮、牛皮癣等。利用干细胞移植法：使用大剂量化疗联合自体HSC治疗顽固高危AD临床上已有AD患者痊愈的实例（见表32）,（5）治疗自身免疫性疾病(AD),62,表 32 AHSCT治疗部分自身免疫病的情况,63,（6）HSC与基因治疗,基因治疗是将外源基因转入靶细胞，通过在患者体内表达来纠正和治疗疾病的过程。HSC可作为基因治疗的靶细胞，具备如下优势：许多遗传病与造血细胞异常有关；HSC自我更新和多向分化的双重特征使转移导入HSC内的目的基因在整个生命过程的血细胞中都表达，并能将目的基因产物直接释放入血循环而到达靶器官或在循环中发挥作用；,64,除可以分化为各系血细胞外，造血干细胞还
21、可以分化为多种非造血组织的细胞。,例：,从HSC肌肉细胞 从HSC肝脏细胞 从HSC神经细胞从HSC血管内皮细胞 从HSC多组织上皮细胞,（7）造血干细胞的可塑性,65,1、何谓胚胎干细胞（ES）,（1）ES定义胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）是指由哺乳动物囊胚的内细胞群(inner cell mass，ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cell，PGC)分离出来的，能够在体外建系的多能干细胞。它具有与胚胎细胞相似的形态和分化潜能，具有分化为机体任何一种组织器官的潜能，习惯上称之为胚胎干细胞。,9.3.2 胚胎干细胞,66,（2）ES的来源胚泡
22、 存活57天的胚胎由大约140个细胞所组成，看上去像黏稠的浆果或花粉粒。它们通体毛绒绒，相互依偎着呈空心的圆球状。,67,滋养层 胚泡的外层组织即滋养层，由一层扁 平的细胞组成，会发育成胎盘。囊胚腔 胚泡中心的腔内细胞团 腔内一侧的细胞群，它是由受精 卵分裂得到的约1633个细胞组成。胚胎干细胞由内细胞团分离培养建系！(见图),68,图5-8 囊胚的内细胞团和滋养层,69,70,71,72,73,74,75,76,77,（3）ES的全能性 存在于内细胞团中的ES尚未决定今后生长发育的走向，但它们均具有“全能性”，亦即可演变为200多种构成从心脏、肝脏、肾到皮肤、神经元等人体任何一种器官组织的组
23、成细胞。(见图),78,合子,囊胚,外胚层,中胚层,内胚层,生殖细胞,表皮细胞,神经经元,色素细胞,心肌细胞,骨骼肌细胞,肾小管细胞,红细胞,平滑肌细胞,胰腺细胞,甲状腺细胞,肺细胞,精子,卵子,原肠胚,79,（4）胚胎干细胞的特点,(1)具有多向分化潜能和受精卵的某些特性，可以分化为胎儿和成体内各种类型的组织细胞，所以这种细胞也称为“全能细胞”；(2)具有非特异性，它不具有特异的组织特征，不能行使特异的组织功能，例如胚胎干细胞不能像红细胞那样携带氧气。(3)可在体外培养条件下建立稳定的细胞系，能够进行长期的增殖和自我更新，并保持高度未分化状态和发育潜能性；(4)体外ESC具有培养细胞的特征，
24、最大特色是可对它进行遗传改造、核转移和冻存等而不失去发育潜能。,80,（4）ES的分离及建系,从胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离(1995年）从终止妊娠的胎儿组织中分离（1998年）利用克隆技术制造出人体胚胎并从中摘取(见图),81,1.体細胞,2.去核卵細胞,3.体外培养,4.胚囊,Inner cell mass(ICM),6.幹細胞,5.培養ICM細胞,7.神經細胞心肌組織肝細胞,治疗性克隆,82,ESC最诱人的前景和用途是生产组织和细胞，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。,治疗慢性心脏病,慢性心肌病病人的心脏已经无法正常跳动，若从ESC中发育出健康心肌细胞，并移植到逐渐衰退
25、的心肌肌肉中，以使恢复衰退的心脏功能。,2、胚胎干细胞应用的潜力（1）细胞替代治疗疾病,83,84,型糖尿病人特异的胰岛（即胰腺）细胞生成胰岛素的功能遭到破坏。可将人类ESC转化为能制造胰岛素的细胞:首先从受精后数日的人类胚胎萃取ES，在培养皿中诱导产生具有分泌胰岛素功能的细胞 称胰小岛细胞或细胞，将胰小岛细胞移植到患者体内，产生健康的胰小岛 细胞，以分泌与控制胰岛素，用来治疗糖尿病。,治疗糖尿病,85,86,干细胞疗法治其它疾病,肝炎或肝硬化 干细胞注射植入肝脏,风湿性关节炎和骨关节 置换受损软骨,大面积烧伤 提供新的皮肤,脊椎神经受伤 缓解病情大脑原动皮层中风 缓解病情老年痴呆症 缓解病情
26、帕金森症 缓解病情,指：给病人植入ES进行干细胞治疗,87,胚胎细胞如何变成彼此不同的类型细胞，又是什么原因使之构成器官和组织？可以培育出大量人胚胎发育过程中不同时期的细胞，通过对它们基因的研究观察，也有望认识畸形胎儿发生的机制。可以确定参与导致细胞特异分化的决定因素，主要是指发育阶段的相关基因，以及使之启动和关闭的影响因素；,(2)揭示人和动物的发育机制及影响因素,88,用于药物筛选当ES细胞系实验表明药品是安全且效果良好，才有资格在实验室进行动物和人体的进一步实验，大大减少了所需动物的数量，降低成本，提高效率。,(3)药学研究方面,89,(4)在基因治疗方面的应用,基因治疗是指用遗传改造过
27、的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病的目的。遗传改造包括：纠正病人体内存在的基因突变使所需基因信息传递到某些特定的类型细胞,90,按分化潜能分类,全能干细胞 胚胎干细胞,多能干细胞,造血干细胞间充质干细胞（MSC）神经干细胞肌肉干细胞皮肤干细胞,9.3.3 其它类型的干细胞,91,专能干细胞,肝干细胞胰腺干细胞肠上皮干细胞角膜缘干细胞生殖干细胞（GSC）,92,9.4.1 干细胞工程的应用前景1、未来干细胞工程的理想阶段希望在体外进行“器官克隆”以供病人移植,病人体细胞核核移入去核的成熟受体卵母细胞早期胚胎分离人胚胎干细胞基因修饰定向分化培养组织或器官移植给病人（见图）,9.4
28、 干细胞工程展望,93,94,2、器官培养工业化如果这一设想能够实现，将是人类医学史中一项划时代的成就，干细胞工程将使器官培养工业化，解决供体器官来源不足的问题；使器官供应专业化，提供病人特异性器官。,科幻电影中的情节正一步步向我们的现实生活中走来！,95,3、“长生不老”的希望 目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。假如在年老时能使用上自己或他人的婴幼儿时期采集保存的干细胞及其衍生组织，那么人类长期追求的“长生不老”的幻想就有可能成为现实！,96,9.4.2 面临的挑战,干细胞的获取与社会伦理争论干细胞分化的控制 高度纯化的干细胞的分离功能完善的人体器官的制造,结 束,
