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1、RNAi技术,主讲人：方中明,RNA的分类,RNAi技术,一、RNAi的发现,三、RNAi的作用机制,二、RNAi的概念,四、RNAi的特点,五、RNAi的技术应用,六、RNAi的发展前景,RNAi技术,AndrewFire,CraigMello,2006年诺贝尔生理学奖,一、RNAi的发现,1998年Andrew Fire和Craig Mello等人首次证实双链RNA分子可诱导同源目标mRNA降解，导致特定基因表达沉默，并将其命名为RNA干扰2001年Tuschl，Phil Sharp等人在Nature上首次证实哺乳动物细胞中存在RNAi机制2002年Science加州大学里弗塞德分校的Sh
2、ou-Wei Ding等人首次证明动物细胞利用RNA沉默来抵御病毒侵染2006年Eugene Koonin等人又证明原核生物里存在类似于真核生物RNA干扰系统的RNA沉默机制,被Science杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。,RNAi（RNA interference）,RNAi（RNAi interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是一种转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silenci
3、ng,PTGS)。,二、RNAi的概念,RNAi现象的普遍性,RNAi普遍存在于水稻、烟草、果蝇及人等几乎所有真核生物中；RNAi能高效的特异阻断基因的表达，在线虫和果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果,直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)，在细胞质核酸酶Dicer的作用下可将长双链RNA降解为21-23bp的小分子干扰RNA（siRNAs）这些siRNAs结合其他元件形成“RNA诱导沉默复合物”(RISCs)，并引导RISCs结合到与之互补的mRNA序列上，降解对应的mRNA 导致对应蛋白质水平下降，最终导致目标基因表达沉默(见图，线路1，蓝色),非哺乳动物细胞RNAi技术路线,转录水
4、平,转录后水平,RNAi作用机制的两种水平,三、RNAi作用机制,哺乳动物细胞RNAi技术路线,直接制备19-23bp左右的siRNAs，将siRNAs转入哺乳动物细胞(线路2，红色)或是将短发夹结构RNA(shRNAs)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到siRNA(线路3，黄色)最后siRNAs和其他元件组合成为RNA诱导的沉默复合物RISCs，在siRNA指引下识别对应的mRNA序列并降解mRNA，从而使特定基因表达沉默,RNAi技术机制路线图,siRNA诱导的基因沉默,病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞
5、进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，作用机制其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。,RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的
6、断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。,Dicer(DCR）：是RNAase 家族中的一员，主要切割dsRNA或者茎环结构的RNA前体成为小RNAs分子。对应地，我们将这种小RNAs分子命名为siRNAs和miRNA。Dicer有着较多的结构域，最先在果蝇中
7、发现，并且在不同的生物体上表现出很高的保守性。MicroRNA(miRNA）：是含有茎环结构的miRNA前体，经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子（21-23个核苷酸）。MiRNA，以及miRISCs（RNA-蛋白质复合物）在动物和植物中广泛表达。因之具有破坏目标特异性基因的转录产物或者诱导翻译抑制的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。,RNAi具有的特征,RNAi是转录后水平的基因沉默机制；RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA；RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远
8、远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；,RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点；dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量
9、。,四、RNAi的特点,生物体内广泛存在的RNAi作用是什么？,在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分子micro RNA(miRNA)。这种内源性的小分子RNA针对3端非编码区，有着极高的保守性，并在组织中广泛表达，可在转录后以及翻译水平上调控基因表达。,病毒防御,RNA沉默被认为是低等生物和植物抗病毒防御系统的一道防线,基因调控,五、RNAi技术应用,基因沉默工具,RNAi主要通过转录后水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，当关闭非必须或致病基因的功能。从理论上说，若能抑制致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验证明，可以通过RNAi的方法是胆固醇升
10、高的基因“沉默”：病毒性疾病、眼疾、心血管代谢性疾病等方面的临床实验也正在进行；这一方法为病毒性肝炎，艾滋病，肿瘤等等人类顽疾的治疗指明道路。,RNAi文库,随着人类基因组计划的完成和蛋白质组研究的开展，我们的视野不再局限于单个的基因，整个研究领域都在期待呼唤更为强大的、全基因组高度的基因功能研究工具。,RNAi文库(RNAi library)是人工构建的能通过诱导沉 默众多不同基因表达的组合文库，可以用于建立功能缺陷(loss of function)的生物或细胞库，进行表型的筛选。,临床疾病治疗,病毒性疾病的治疗,设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1
11、的辅助受体CCR5进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的辅助受体CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,HIV-1 淋巴球出芽,遗传性疾病的治疗,美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi与脆性染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。,遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热
12、点。,肿瘤病的治疗,RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。,小鼠黑色素瘤细胞,在整形外科领域的应用前景,N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变，而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。,使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定
13、了基础。,最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。,在植物学中的应用,Napoli等将1个查尔酮合成酶基因(chs)置于1个强启动子后导人矮牵牛，试图加深花朵的紫颜色。结果部分花的颜色并非期待中的深紫色，而是形成了花斑状甚至白色，而且这种性状可以遗传。,由于导入的基因和其同源的内源基因同时都被抑制，他们将这种现象命名为共抑制(co-suppression)。,六、RNAi发展展望,未发现RNAi
14、之前，曾利用反义RNA与靶mRNA 序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，RNAi 技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。,所以RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展，还有可能设计出RNAi芯片，高通量地筛选药物靶基，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能。,由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。,RNAi
15、研究的一般技术路线,植物RNAi设计要点,在网站 http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 对编码区cDNA 进行序列比对，选择与其他基因无同源性的外显子区段。确定拟干扰的外显子区段，大小 100-300bp，设计合适的引物扩增区段，两头各加两个酶切位点。用 Kpn和 BamH酶切回收外显子区段1。将此区段连于载体上。用 Spe和 Sac酶切回收外显子区段2。将此区段连于载体上。,RNA干扰效率的检测（体外）,一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。,文献检索 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
16、/基因和蛋白同源性比较 http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi蛋白质组学和蛋白修饰 http:/www.expasy.org/基因组学 http:/genome.ucsc.edu/基因芯片http:/www.ebi.ac.uk/microarray/蛋白质结构 http:/www.rcsb.org/pdb/home/home.doMicroRNA或siRNA http:/www.mirz.unibas.ch/smiRNAdb/cgi/smiRNAdb?page=home基因表达 http:/www.cleanex.isb-sib.ch/真核启动子 http:/www.epd.isb-sib.ch/,
