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1、所在系部:项目名称:项目负责人:学号:项目类型:项目级别:指导教师:指导教师单位:项目起止:项目编号：S厦门医学院“大学生创新创业训练计划”项目结题验收表药学系基于化疗药索拉菲尼在肿瘤细胞内的耐药机制及代谢组学研究余惟一4创新训练口创业训练口创业实践口国家级4省级口校级祝珊珊药学系2021年6月至2023年6月教务处2022年3月13日项目负责人姓名余惟一性别男学号所在系药学系E-mail电话主要成员(不含负责人)姓名性别所在系专业班级学号项目分工陈志昭男药学系生物制药二班分子生物学实验王雪颖女药学系生物制药一班RT-PCR实验及流式凋亡指导教师姓名祝珊珊职称实验师学历/学位硕士研究生单位厦门
2、医学院药学系邮箱联系电话项目名称基于化疗药索拉菲尼在肿瘤细胞内的耐药机制及代谢组学研究项目结题报告一、项目简介及项目创新点近年来，癌症的发病率和死亡率不断上升。2020年，我国新发恶性肿瘤人数和恶性肿瘤死亡人数均位居全球第一。2021年1月，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)等发布的2020年全球癌症数据显示，2020年全球新发恶性肿瘤病例1929万例，中国新发恶性肿瘤457万人，占全球23.7%；2020年全球恶性肿瘤死亡病例996万例，中国恶性肿瘤死亡人数300万，占全球30%。作为一种多靶点的激酶抑制剂，索拉菲尼可抑制多种肿痛细胞的生长，目前主要用于治疗不能手术或者远处转移性肝癌晚
3、期患者。尽管索拉菲尼提高了肿瘤患者的总体生存率，在肿瘤患者体内发现了对索拉菲尼的获得性耐药，这导致了不良的治疗预后效果，即肿痛细胞对索拉菲尼的耐药性限制了其治疗作用的好处。因此，探索索拉菲尼的耐药作用机制以及寻找和筛选细胞内的代谢靶点是目前治疗肿痛的关键。本项目将通过乳腺癌、肝癌和肺癌三种肿瘤细胞，探索索拉菲尼在肿痛细胞内的耐药机理以及代谢组学变化，为寻找索拉非尼的耐药作用提供依据。本项目的创新点在于对化疗药索拉菲尼在多种肿瘤细胞内的耐药机制和药物代谢网络途径做个比较全面的串联；本项目的特色在于探索索拉菲尼的耐药作用机制及其代谢途径，为目前肿瘤治疗突破化疗药耐药的关键。二、项目申报时的预期效果
4、通过对实验数据的分析阐明索拉菲尼在肿痛细胞内耐药机理和途径。索拉菲尼是种新型多靶向能抑制多种癌基因激酶活性的药物，在治疗肺癌、甲状腺癌、胰腺癌以及乳腺癌中也见报道，也是唯被批准作为治疗晚期肝癌的系统性药物。索拉菲尼的获得性耐药导致了不良的治疗预后效果。本研究将从细胞生物学和分子生物学角度研究索拉菲尼在肿瘤细胞内的耐药机理，并通过代谢组学研究索拉非尼在肿痛细胞以及肿瘤组织中的代谢通路，探索化疗药索拉非尼的代谢途径，助力突破肿瘤化疗药耐药的代谢机制。本项目预期发表文章1-2篇。三、项目实施情况(就研究目标、研究过程、研究成果、研究体会和心得作全面总结)本项目拟首先确定索拉非尼在几种不同肿瘤细胞内的
5、细胞毒性作用，对乳腺癌MCF-7、肝癌huh-7、肺癌A549细胞进行细胞毒和凋亡实验，寻找索拉非尼的IC50浓度。在此基础上，于分子水平研究索拉非尼对乳腺癌MCF-7、肝癌huh-7、肺癌A549细胞相关凋亡基因Bcl-2和Bax,细胞周期蛋白CfyC表达的影响。与此同时，研究索拉非尼对耐药基因ABCC2、ABCG2以及ABCBl的影响，以及对参与调控肿瘤耐药的关键信通路Wnt和Notch的影响，并利用超高效液相色谱-质谱联用仪对肿瘤细胞和组织内的药物代谢途径进行代谢组学高通量分析。最后通过分析上述实验数据得到索拉非尼在几种肿瘤内的药物耐药的代谢组学信息。本研究将从细胞生物学和分子生物学角度
6、研究索拉菲尼在肿瘤细胞内的耐药机理，并通过与PTEN联合研究两者在肿瘤细胞和组织内对耐药调节的关系，最后利用代谢组学研究索拉非尼的代谢通路，探索化疗药索拉非尼的代谢途径，助力突破肿瘤化疗药耐药的代谢机制。为寻找更为安全有效的治疗靶点提供新思路。1、与本项目有关的研究积累和已取得的成绩：本项目首先在肝癌细胞HUh-7中的实验结果如下所示：1.1索拉菲尼对肝癌细胞Huh-7凋亡的影响索拉菲尼作用于肝癌细胞HUh-724h后，流式凋亡双染结果如图1所示，与对照组相比，随着索拉菲尼浓度升高，Huh-7细胞的早期凋亡率升高，说明索拉非尼在肝癌细胞Huh-7内能促进细胞的凋亡。图1流式凋亡检测索拉菲尼对H
7、Uh-7细胞的凋亡作用1.2索拉菲尼对肝癌细胞内耐药基因蛋白表达的影响为探讨索拉菲尼处理后对Huh-7细胞内耐药基因ABCBKABCC2和ABCG2蛋白表达的作用，如图2所示，随着索拉非尼在细胞内加药浓度的增加，各个耐药基因蛋白表达均有下降趋势，但是我们有在加大浓度的实验结果会发现索拉非尼在15国后，耐药基因表达增高。另外，HUh-7细胞内PTEN的蛋白随着药物浓度的增加而上调；抑制细胞凋亡的蛋白Bcl-2和磷酸酶p-KT蛋白表达降低，这与前面索拉非尼能增加细胞凋亡的结果一致。PTEN是一个在多数肿痛中表达缺失的抑癌基因，在索拉菲尼加药诱导后，表达增加，说明索拉菲尼激活了细胞内PTEN的表达。
8、图2：索拉菲尼处理HUh-7细胞后蛋白表达情况1.3索拉非尼对耐药基因ABCG2和ABCC2以及抑癌基因PTEN表达的影响我们通过RT-PCR实验，对索拉非尼加药后的HUh-72细胞内的基因进行扩增实验，发现，索拉非尼能抑制ABeC2和ABCG2的InRNA表达，如图3A和B所示；另外，索拉非尼能增加PTEN的基因表达（图3C）,说明索拉非尼对PTEN的表达从基因水平的转录就开始了。图3索拉非尼对ABCC2、ABCG2和PTEN基因表达的影响1.4PTEN过表达对索拉非尼作用肝细胞肝癌的影响我们通过外源过表达质粒PTEN转染到肝癌细胞内，再加入索拉非尼处理，发现PTEN的过表达能增强由索拉非尼
9、引起的细胞凋亡，如图4流式细胞凋亡实验所示，PTEN过表达能诱导细胞凋亡增加。图4PTEN增强索拉非尼在肝癌细胞内的凋亡作用1.5PTEN过表达对索拉非尼作用于肝细胞肝癌后耐药基因的影响我们在肝癌HUh-7细胞内过表达外源质粒后，与对照组PlVX-COn相比，如图5所示，加入索拉非尼5MM(so)处理后，PTEN的蛋白表达增加，实验组plvx-pten过表达PTEN后，再加入索拉非尼处理，PTEN的蛋白表达更强，而耐药基因蛋白ABCC2和ABCG2在单独索拉非尼加药组和过表达PTEN再加药组均下降，PTEN过表达加药组的耐药基因蛋白下降更明显，这结果说明PTEN能促进索拉非尼对耐药基因ABCC
10、2和ABCG2蛋白表达的下调作用。磷酸化蛋白p-AKT和抗凋亡蛋白BCL-2表达也下降，这与之前凋亡组的实验结果一致。说明PTEN能促进索拉非尼的凋亡作用。图5PTEN能促进索拉非尼在细胞内的抗耐药作用通过上面的实验结果，我们已经在肝癌细胞HUh-7内完成了索拉非尼促进细胞凋亡与调节耐药基因表达的部分实验,对于实验方法和技术有了一定的掌握。四、项目实验过程中存在的问题及改进设想、建议目前，药学系药物检测中心实验室拥有细胞生物学实验大型平台：包含两个洁净细胞间；激光共聚显微镜和高内涵细胞筛选系统组成的显微观察平台；以及贝克曼流式细胞仪和高速离心机；Bio-rad蛋白电泳系统，免疫化学发光仪以及分
11、子生物学实验室和基因功能实验室。目前，我们已经在一株肝癌细胞内完成了部分实验结果，但因耐药株的生长较慢，因此往乳腺癌的方向做了创新性尝试，我们采用了榔皮素。棚皮素是黄酮醇类黄酮亚类的主要代表，广泛存在于水果和蔬菜中，是饮食中最常见的黄酮醇之一。众多研究显示，棚皮素可以通过调节多种信号通路靶点蛋白或基因调控肿瘤的发生和发展进程，我们的实验结果发现榔皮素能促进MCF-7细胞中PTEN的蛋白表达，抑制JNK蛋白的磷酸化水平，免疫荧光结果显示P-JNK的蛋白表达随着棚皮素浓度增加而减弱，且p-JNK表达减弱是从核内逐渐向细胞膜进行扩散的过程，即P-JNK蛋白在核内的转录和翻译越来越弱，逐渐向外延伸，而
12、PTEN蛋白表达的免疫荧光结果与P-JNK正好相反。这有可能与棚皮素在MCF-7中的作用是通过募集细胞核内的PTEN表达从而阻断p-JNK蛋白在细胞核内的基因转录和翻译，进而使p-JNK的表达逐渐降低的一个过程。我们利用PI3K/AKT通路的抑制剂LY294002的研究结果显示，通过LY294002减弱PI3K/AKT通路的活性可增强乳腺癌MCF-7细胞的凋亡作用，LY294002联合榔皮素组能明显增强MCF-7细胞的凋亡，与对照组相比对PTEN蛋白的核表达和细胞质表达明显增强，LY294002抑制剂的使用证实棚皮素对细胞凋亡的作用是通过调节PI3K/AKT的磷酸化作用发生的。而联合用药的结果
13、为今后抗癌的方向增加一种新的方式。该研究成果已经撰写论文，已投稿至细胞与分子免疫学杂志，已被接收，预计2022年10月出版发行。五、项目最终成果（一）成果统计（在以下括号内填写数量，无则填0）1、发表论文，份，2、专利份，3、调研报告份，4、软件2份，5、实物芨说明2份，6、设计方案2份，7、图纸汇编份,8、竞赛获奖诙9、其他成果E份（二）成果清箪序号成果名称（获奖名称及等级）成果形式作者（获奖者）出版社、刊物名或颁奖单位时间（刊期）备注1榔皮素诱导乳腺癌细胞凋亡及其与PTEN/P13K/AKT以及JNK信号通路的相关性研究论文祝珊珊，余惟一等细胞与分子免疫学待发表预计2022年10月23（）
14、成果材料（提供佐证材料附在后面）六、经费使用情况及分析项目总经费（元）15000名目用途金额（元）备注论文版面费发表文章的版面费4800专利申请费调研、差旅费打印、复印费资料费试剂等耗材费购买实验试剂和耗材2316.48元器件、软硬件测试、小型硬件购置费其它经费已使用合计（元）7116.48经费结余（元）7883.52项目负责人签字：年月日指导教师评语请指导教师对该项目的研究路线、研究方法、研究方案、研究成果、经费使用情况等做出具体评价。指导教师签字：年月日所在系部意见对项目进行综合评价与建议，并对项目能否结题等情况作出说明。负责人签字（盖章）年月日教务处意见对项目进行综合评价与建议，并对项目能否结题等情况作出说明。负责人签字（盖章）年月日评审结果（请打“）通过暂缓通过不合格
