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1、焦磷酸序列分析仪 PyroMark系列 技术与产品简介,凯杰生物技术（上海）有限公司,Pyrosequencing技术原理PyroMark系列产品主要应用方向软件演示,Pyrosequencing-焦磷酸测序技术,唯一得到定量序列结果的技术极高的准确性99.6%的基因分型准确率内置质控，直接反映实验成功与否100%的数据重现性通用型技术平台，功能多样，应用领域极广可以用于任何遗传多态性的分析甲基化研究的最佳平台高通量、低成本的快速临床微生物诊断实验设计灵活自动化程度高，操作简单强大的技术支持,Pyrosequencing技术定位,焦磷酸测序技术是唯一一种可以在短时间内同时给出序列信息和定量结果
2、的技术,Sanger双脱氧测序,焦磷酸测序,实验设计,Pyrosequencing技术原理工作流程,Pyrosequencing 技术的流程,PCR,试样预处理，获得单链模板,Pyrosequencing序列分析,15 min/96 sample,SQA:60 min/96 sample,SNP:10min/96 sample,1-2h/96 sample,结果分析,C/T T/T,实验设计,Pyrosequencing技术原理第一步：实验设计,实验设计PyroMark Assay Design Software 2.0简便易用的软件，可同时设计PCR与测序引物软件适用于所有类型的PyroMa
3、rk仪器输入目标序列，仅需简单三步，即可完成实验设计可根据软件给出的评估分数，选择最佳的实验方案,Step 1,Step 2,Step 3,Pyrosequencing技术原理第二步：PCR反应,实验设计PCR反应PCR产物长度在80-200 bp之间为宜其中一条PCR引物需在末端以生物素标记,PCR primer,Region of interest,PCR primer,Sequencing primer,Pyrosequencing技术原理第三步：样品制备,实验设计PCR反应样品制备以链霉亲和素包被的微球捕捉生物素标记的PCR产物在NaOH溶液中变性分离两条链洗涤/中和被捕捉固定的单链与
4、测序引物退火在专用附属仪器内自动完成,PyroMark Vacuum Workstation,PCR product immobilized on Sepharose beads,Analysis plate with sequencing primer,EtOH,Denaturation Solution(NaOH),Wash buffer,Water,PyroMark Q96 ID/MD,PyroMark Q24,Pyrosequencing技术原理第四步：Pyrosequencing反应,实验设计PCR反应样品制备Pyrosequencing仪器向待检测样品中每次只加入一个核苷酸碱基(d
5、NTP)互补的碱基结合在模板上时，会释放出焦磷酸基团Pyrophosphate(PPi)PPi在ATP硫酸化酶(ATP Sulfurylase)作用下，合成ATP，ATP作为能量分子，驱动荧光素在荧光素酶(Luciferase)的催化下转化为氧化荧光素，并发出与ATP能量成正比的荧光信号信号被CCD数码相机捕捉，形成峰形PyrogramTM未与模板结合的碱基将被三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)降解加入下一种dNTP,PPi,ATP,PPi,ATP,Principle of Pyrosequencing,APS,Luciferin,硫酸化酶,双磷酸酶,荧光素酶,C G TT CC A CC
6、T,每次向反应体系中加入一种dNTP 相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况 峰高与掺入的核苷酸数量成正比 多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解,Pyrogram,结果示例,峰形图Pyrogram峰高与结合模板的dNTP数量成正比原始数据会被软件自动转化为序列信息,序列信息,依次加入的dNTP,核苷酸序列,原理动画演示,Pyrosequencing技术原理PyroMark系列产品主要应用方向软件演示,PyroMark全线产品包括仪器与相应试剂,Instruments,Sample preparation,Software,PCR Kits,Reagents,Assay Kits,Pyr
7、oMark Q24,PyroMark Q96 ID,PyroMark Q96 MD,PyroMark Q24 Workstation,PyroMark仪器系列一览Q24,Q96 ID,Q96 MD,Q96 MD Automated,*需加装软件PyroMark CpG sw,Pyrosequencing技术原理PyroMark系列产品主要应用方向软件演示,Pyrosequencing技术应用方向一览,35%,大规模遗传筛查关联/连锁分析,微生物鉴定从头测序，突变鉴定，耐药性研究,个体化医疗针对癌症及正常组织的混合样本进行分型,甲基化研究精确给出甲基化程度,SNP检测有能力检测到人群中频度仅为1
8、%的多态性位点,法医鉴定线粒体分型及突变定量,Pyrosequencing应用与仪器,AGTAGCGCATAC A GTAGCGCAGTAGCGCAT,TCATCGCGTATG T CATCGCGTCATCGCGTA,AGTA GC/Cm GAATACAGTA GC/Cm TCAGTAG,TCAT C/CmG CTTATGTCAT C/CmG AGTCATC,分析多态性位点 基因分型(SNP,mutations)等位基因定量CpG 甲基化定量分析分析未知序列从头测序,AGTAGCGCATAC G GTAGCGCAGTAGCGCAT,TCATCGCGTATG C CATCGCGTCATCGCGT
9、A,SNP,AQ,AQ,SQA,AGTAGCGC?CAGTAGCGCAT,TCATCGCG?GTCATCGCGTA,Genetic Testing,Epigenetics,Microbiology,ratio,%,%,Insertion/Deletion,Genetic Testing,Epigenetics,Microbiology,PyroMark Q24,PyroMark Q96 ID,PyroMark Q96 MD,PyroMark Q24,PyroMark Q96 ID,PyroMark Q96 MD,PyroMark Q96 ID,SNP,AQ,AQ,SQA,Pyrosequenc
10、ing应用与仪器,分析多态性位点 基因分型(SNP,mutations)等位基因定量CpG 甲基化定量分析分析未知序列从头测序,Genetic Testing,Pyrosequencing进行Genotyping的精确性,用Pyrosequencing技术分析RET基因Exon10、11、13、14、16中的共9个突变位点对217个MEN2阴性及230个MEN2阳性患者进行检测阴性符合率100%，阳性符合率99.6%,Conclusion：Pyrosequencing technology offers an accurate,simple,and rapid method for the a
11、nalysis of DNA from patients suspected of having MEN2.,SNP typing示例,待分析序列：a/g C T G C C T,C,T,C,G,T,T,C,A,G,C,T,C,G,T,T,C,A,G,Single height ref peaks,Double height ref peak,待分析序列：a/g C T G C C T,SNP typing示例,阴性对照,参照峰,C,T,C,G,T,T,C,A,G,阴性对照,参照峰,Single height ref peaks,Double height ref peak,2 half he
12、ight peaks,待分析序列：a/g C T G C C T基因型：A/G杂合,SNP typing示例,应用实例 KRAS基因突变与肿瘤药物基因组学,Inhibition of cell proliferation and survival,EGF受体(EGFR)，肿瘤治疗的重要靶点直肠癌Anti-EGFR抗体类药物：Erbitux(Imclone),Vectibix(Amgen)等成功的anti-EGFR治疗可以阻断细胞增殖和存活,EGFR,KRAS,Growth factors,Cell membrane,Monoclonal antibodies Cetuximab(Erbitux
13、)Panitumumab(Vectibix),Y,Cell proliferation and survival,KRAS基因中的突变会使得KRAS被持续活化，导致对anti-EGFR抗体类药物的耐药性KRAS突变为复杂的多位点突变最常见的KRAS活化突变见于编码子12，13和61位肿瘤组织中KRAS基因的突变可以对特定药物的诊疗和预后起到指导性作用,应用实例 KRAS基因突变与肿瘤药物基因组学,Inhibition of cell proliferation and survival,EGF受体(EGFR)，肿瘤治疗的重要靶点直肠癌Anti-EGFR抗体类药物：Erbitux(Imclone
14、),Vectibix(Amgen)等成功的anti-EGFR治疗可以阻断细胞增殖和存活,KRAS基因编码子12，13和61位的重要突变示意,EGFR,KRAS,Growth factors,Cell membrane,Monoclonal antibodies Cetuximab(Erbitux)Panitumumab(Vectibix),Y,Cell proliferation and survival,KRAS基因中的突变会使得KRAS被持续活化，导致对anti-EGFR抗体类药物的耐药性KRAS突变为复杂的多位点突变最常见的KRAS活化突变见于编码子12，13和61位肿瘤组织中KRAS基
15、因的突变可以对特定药物的诊疗和预后起到指导性作用,应用实例 KRAS基因突变与肿瘤药物基因组学,PyroMark KRAS Assay检测结果,Patient no.1,Analysis of codon 12/13,Sequence to analyze:GGT GGC GTA GG,wt K-Ras,Patient no.3,Data provided by Dr Magnus Sundstrom,Uppsala University Hospital,Sweden using PyroMark KRAS 2.0,Codon 13 mutation:GGC GAC,PyroMark KRA
16、S Assay检测结果,Codon 61 reads=CAASequence to analyze:CTC TTG ACCT(Reverse assay design),Data provided by Dr Magnus Sundstrom,Uppsala University Hospital,Sweden using PyroMark KRAS 2.0,Analysis of codon 61,Epigenetics,表观遗传学DNA甲基化,DNA甲基化向CpG双碱基的胞嘧啶上加入一个甲基基团过程可逆,CpG甲基化岛CpG双碱基排列出现频度很高:每10个碱基中即出现一次CpG甲基化岛常在
17、启动子区域中出现CpG甲基化岛在60%的启动子区域内存在,功能被甲基化的基因将被沉默，不能表达人体内70-80%的CpG岛被甲基化大多数未甲基化的CpG位于调控区域内与肿瘤发病的相关性重要的抑癌基因过甲基化或被沉默致癌基因的去甲基化或活化,DNA 甲基化研究 重硫酸盐转化,重亚硫酸盐处理的作用：重亚硫酸盐将所有未被甲基化的C（胞嘧啶）转化为U（尿嘧啶）CpG序列中已经被甲基化的C不受影响在随后的PCR反应中，U被T（胸腺嘧啶）替代至此，重亚硫酸盐处理过的甲基化序列可得以分析相当于C/T突变,G,G,T,C,A,G,T,G,A,C,G,G,G,T,U,A,G,T,G,A,U,G,G,G,T,T,
18、A,G,T,G,A,T,G,G,G,T,C,A,G,T,G,A,mC,G,G,G,T,U,A,G,T,G,A,C,G,G,G,T,T,A,G,T,G,A,C,G,Bisulfite Conversion,PCR,Bisulfite Conversion,PCR,Pyrosequencing甲基化定量研究,A G T T A C G A C,待分析序列:,重亚硫酸盐处理后序列:,A G T T A CmG A C,A G T T A C G A C,and,A G T T A C G A T,A G T T A T G A T,and,A,G,T,A,A,T,C,C,T,A,G,T,A,A,C,
19、G,T,T,G,27%,分析序列:CpG 甲基化水平:,核苷酸添加顺序:,内参:重亚硫酸盐转化完全,灰色区域:甲基化区域(CpG sites),被软件分别定量黄色区域:重硫酸盐处理内参照，可有效反映重硫酸盐处理完全程度（任何一个后面不是G的C碱基都可作为质控内参）,Sequence to analyze:,C/TGTTTTGC/TGTTTC/TGAC/TGTTC/TGTAGGTTTTC/TGC/TGGTGC/TGTATC/TGTTTGC/TGA,Pyrosequencing甲基化定量研究,39,PyroMark Assay Design Software 2.0甲基化分析程序,用于CpG检测实
20、验设计Step 1:输入原始序列软件将序列转为重硫酸盐处理后的序列软件自动识别所有CpG位点，并以粗体标记软件以颜色显示可能的重硫酸处理内标位点Step 2:用户选择感兴趣的序列，程序自动给出多组引物设计方案及相应分数Step 3:根据分数选择实验设计方案,Step 1,Step 2,Step 3,SequenceContext,软件自动分析结果,CpG Sites,BisulphiteTreatmentControl,Individual Degree of Methylation,平均甲基化频度,与预设甲基化程度值的偏离,各位点实验质量评估,最终分析结果图例,Microbiology,对高
21、突变区域16S rDNA gene或rnpB gene进行测序扩增与测序引物均位于保守序列区域测序引物在突变区域之前96个样本在1小时内完成测序测序结果自动与仪器内自带的IdentiFire微生物数据库进行比对细菌鉴定，真菌鉴定，病毒突变及耐药性检测,Pyrosequencing微生物鉴定,Pyrosequencing微生物耐药性分析,Rifampicin resistance mutation TTGG(wt=TCGG),Rifampicin（抗结核药物利福平）耐药性rpoB基因中，96%的突变位于一段长度为81 bp的区域内,Pyrosequencing微生物耐药性分析,Pyrosequencing微生物耐药性分析,Resistance to Adamantanes,Pyrosequencing微生物耐药性分析,Resistance to Tamifu,成熟商业化试剂盒,谢谢！,
