临床微生物实验室必须进行规范化革命.ppt

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1、临床微生物实验室必须进行规范化革命,卫生部北京医院张秀珍,人类面临着微生物的挑战,要打赢这场战争不仅需要有经验的医生,还需要一支优秀的侦察队伍临床微生物检验队伍。临床细菌室规模和发展速度与10年或20年前相比已经发生了巨大的变化,但离CLSI(临床实验室标准化研究所)标准化文件要求还相差很远,基层细菌室必须进行规范操作革命才可能应对微生物向人类的挑战,才能适应临床的需要.,卫生部医政司,2004年制定中国第一版抗菌药物合理应用指南.国务院副总理吴仪也做出了重要批示05年卫生部提出星火培训项目:包括临床医生和细菌实验室06年，耐药菌监测网正式成立包括128家医院。马晓伟提出了“药师管理，合理用药

2、”的指导思想。目前，基层用药尤其是抗生素情况不很乐观。社区医院情况也十分让人担忧。三级医院规模虽然大，但是数量太少。不能满足绝大多数看病者的需求。07年完成了培训教材由人民卫生出版社出版,08年10月启动培训,在北京.,您可能每天面临以下问题的挑战,同时做需氧血培养和厌氧血培养时血液先注入需氧瓶或厌氧瓶？脓标本有时涂片见到细菌为什么培养阴性？非上班时间需要做厌氧培养怎么办？明显细菌性脑膜炎为什么培养阴性？痰标本分离出4种细菌做哪一种细菌的药敏试验？数量很多的凝固酶阴性葡萄球菌在痰里分离出来是否要做药敏?,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前

3、标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规范；,标本采集和运送,标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处,造成的后果是:临床医生最不能接受的问题:阳性率低,棉 花 纤 维+竹/木 条,抑 菌 区 是 因 为：植 物 分 泌 出 来 的：脂 肪 酸；树 脂；福 尔 马 林,氯 气，重 金 属 与 胶 水 的 影 响,美 国 与 欧 洲 对 实 验 室 的 新 要 求,NCCLS M40 标 准 DIN 58942 标 准,C

4、OPAN Amies 运 送 培 养 基,多用途运送系统 需氧+厌氧低 氧 化 的 环 境 不会对标本的微生物造成损害拭 子 是 深 入 培 养 基 中 来 保 护 苛 养 菌 与 厌 氧 菌 两面是以塑料密封,不透水和漏气 减少污染和维持缺氧环境,ASM 2004,流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率,泌尿标本采集的规范,1采集后的标本应立即送检。2采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。3 标本管不应含防腐剂和消毒剂。,泌尿标本采集的规范,1.采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。2.长期留置导尿管

5、的患者应在更换新管时留取尿标本。3.做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。,分泌物采集规范,1.对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。2.闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。,便标本采集规范,1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感

6、染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。,便标本采集规范,3.注意事项：虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。应床边接种或置输送培养基送检。厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。,痰标本的采集和运送,1.标本采集时间：用抗生素前2.采集方法：自然咳痰：必须用请水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭

7、菌容器中或输送培养基中。支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基,厌培养标本采集规范,1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养 3便标本厌氧培养标本采集：可用排出的便做厌氧培养但也应少与空气接触。,CLSI血培养的原则和操作程序推荐（Proposed）指南,2006年10月出版：M47-P只是协商后的推荐稿（consensus proposed）收集来自全球的评论和建议收集截止日期：2007年1月29日下一步要出版投票通过的试行指南,英国HPA 的血培养的研

8、究及操作程序,2005-09-08出版：BSOP 37 Issue 5http:/www.hpa-standards.org.uk/pdf_sops.aspINVESTIGATION OF BLOOD CULTURES(FOR ORGANISMS OTHER THAN MYCOBACTERIUM SPESIES)参编单位：医学微生物协会,临床微生物协会 苏格兰微生物协会,IBMS,Welsh微生物协会统一由卫生防护署（Health Protection Agency）领导,优质的实验室操作,取血合适的时间尽可能抗菌药使用前寒颤和发热初起；心内膜炎（持续性菌血症）例外标本类型和取血方法不要和测血

9、气及血沉的取血同时进行（或在先）穿刺点消毒：以醇类、洗必泰为好,血标本的收集优质的实验室操作,1.从静脉取血2.不宜从静脉导管或静脉留置口取血3.若导管设施取血*，必需同时静脉取血，以求对比和解释不要弃去初段血，不用抗凝剂冲洗 4.不推荐静脉血直接入瓶5.不主张换针头入瓶6.有血的培养瓶不可放入冰箱和冻箱保存,建议,第一天 1-3套血，每套16-20ml第二天,如无迹象有细菌生长1-2套，每套16-20ml,瓶数及血量,结论1：绝对不能只用一瓶寒战升温之间应采血20毫升分装两个瓶内先分配在需氧瓶10ml，然后剩余的入厌氧瓶内，因为真菌、绿脓杆菌、窄食单胞菌只长在需氧瓶内。结论2：2-5天内不必

10、重复取血结论3：只有可疑为持续性菌血症：如心内膜炎、导管相关sepsis时，才要有间隔地(1h至24h)几次取血监测、捕捉、指导治疗；特别是金葡菌时。,血液及骨髓标本采集运送的规范,1.采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外。2.采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套 2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。3.采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。,抽血量和体重的关系,血液及骨髓标本采集运送的规范,4.采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本

11、，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。5.儿童：采血量是总血量的1%。6.延迟培养瓶处理:延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱,放常温，尽早送往临床细菌室。7.皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。,其他无菌体液的采集运送规范,1无菌采集是培养成功的首要因素2采集的标本应立即送至临床细菌室，脑膜炎球菌有自溶酶，离体后回迅速自溶。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌离体后极易死亡。3延迟送检时一定不能放冰箱，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等对温度敏感的细菌在冰箱会很快死亡。,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前标

12、本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规范；,痰培养标本培养前规范,实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色，当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应作为不宜做培养的标本；当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌分布作出判断：,痰培养标本培养前规范,当标本中细菌种类超过3种以上，未见到钎毛拄状上皮细胞，作为不合格标本；如见到数量不等的白血胞或钎毛拄状上皮细胞或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析；当涂片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞，

13、少量或较多钎毛拄状上皮细胞均可按合格标本继续培养。,厌氧培养,在正常上班时间：申请厌氧培养的科室应邀请实验室，由临床医生或护士采集，细菌室行床边接种。自然排出的尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养的标本，应于退检。没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培养基放置标本。,培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌,尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到，应在报告中提示可能是污染细菌建议结合临床表现考虑结果的参考价值。眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。,培养结果

14、结合涂片判断定植菌或致病菌,前列腺液标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。当涂片中见到的细菌，并有细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。,培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌,(5)涂片报告的日期和培养报告日期要对应便于医生判别结果的参考价值.（6）并每一视野可见到20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优势细菌.,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规

15、范；,有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病细菌分离成功。,分离培养规范,痰培养,1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、或加MRSA显色琼脂。2培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、置5-7%CO2、35环境培养，其他培养基置35空气培养。3结核培养：罗氏鸡蛋斜面，每一标本种2支，37空气培养。,尿标本,1培养基：5%羊血琼脂、中国兰或伊红美兰，CP3尿致病菌分离显色琼脂。2.菌落计数：每个标本都要做，用加样器或定量接种环取样本200ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平

16、皿，此日作菌落计数。3培养环境：35空气环境培养,便培养,1培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS琼脂）或加沙门菌分离琼脂。2培养环境：35空气环境培养。3疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35空气环境培养。CCFA置35厌氧环境培养。其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。,脑脊液培养,1培养基：5%兔血巧克力琼脂、5%羊血琼脂。2培养环境：35，5-10%CO2环境培养。,分泌物培养,1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤2培养环境：35空气环境培养。,胆汁或胸水或腹

17、水,1培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤。2培养环境：35空气环境培养。,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规范；,细菌鉴定 涂片染色,涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。1 革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球

18、菌，呈葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。,涂片染色,2.抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌+；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。,细菌鉴定 趋向性鉴定试验,革兰阳性球菌:触酶试验，凝固酶试验革兰阳性球菌:氧化酶试验,血清学试验,肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。,血清学鉴定,1.志贺氏菌多价和单价凝集血清：2.沙门氏菌多价和单价凝集血清3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清4.耶尔森氏菌凝集血清,真菌检测,1每一基层实验室必须开展

19、真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别曲菌或毛霉菌。2开展真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基或用显色培养基。,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规范；,药敏标准,1.用CLS指南推荐的KB药敏标准进行常规药敏试验判断。2.根据CLSI更新及时替换应用的标准。3.根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出

20、建议,标本采集和运送的规范；培养前标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；无菌体液细菌报告规范；,质量控制的规范化,1药物敏感试验的质量控制：应包括30天的初始质量稳定测试；每周一次的常规质量控制；5天的纠控程序。2鉴定试剂质量控制：购入新的试剂；在更换批号；更换生产厂家；结果发生异常等情况时均应进行质量控制。3染色液质量控制：应包括染色结果阳性和阴性的对照物及染色液污染的质量控制。,质量控制内容,4分离培养基：如血琼脂和巧克力，用肺炎链球菌、B-溶血和草绿色溶血的链球菌、流感嗜血杆菌、等苛养细菌的标准菌株或经标准化试剂已证实结果正确的菌株进

21、行测试，判断其分离能力。5.培养箱的质量控制：每天第一个开箱和最后离开实验室均应对培养箱的温度作记录；CO2培养箱还应记录CO2的含量。,质量控制内容,6冰箱温度记录：按每一冰箱存放的物品不同设置不同的质控范围，特别对低温冰箱；每天记录一次。7自动化设备：按厂家提供的SOP文件进行质控；在设备软件升级或修改版本时均应进行质量控制程序。,参考CLSI M2 M7 M42 M47从以下7方面提出建议,标本采集和运送的规范；培养前标本质量检测规范；标本接种规范；细菌鉴定基本流程规范；细菌药物敏感试验规范；实验室质量控制；细菌报告规范；,临床细菌室报告制度,细菌实验室应对不同的细菌检验报告时间和内容应

22、有相应的规定，并告诉临床各科，依此可防止不明原因的报告延迟应分两种报告形式：1.危重感染报告:2.常规报告:,涂片报告,1.革兰染色：危重报告30分钟报告。报告内容应包括染色反应、是细菌或真菌、细菌形态。有无细胞内吞嗜现象，有无菌丝。2.抗酸染色：报告抗酸染色阳性或阴性；菌量以加号表示。常规报告24h,危重报告1h,血液和无菌体液培养的报告制度,实行三级报告制度：第一级：培养液直接涂片结果；第二级：初步药敏结果和平皿菌落涂片结果；第三级：正式细菌鉴定和药敏报告。,便培养,24小时可发出初始报告;72小时应报告药敏试验结果；根据检测范围报告检测结果，如未检测出沙门菌、志贺菌。错误报告:未见到致病菌,尿培养,可在24小时报告初始结果，包括菌落计数和可能细菌种类，如氧化酶阴性的革兰阴性杆菌；金黄色葡萄球菌等。,痰培养,24小时初始报告，报告内容包括痰标本是否合格，优势细菌，金葡菌、铜绿假单孢菌等特征明显细菌的鉴定结果。,分泌物报告,24h初始报告：有无细菌生长；革兰阳性或阴性细菌或特征明显的细菌名称；根据涂片结果推测致病菌。,谢谢大家Thank you,