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1、标记抗体技术,标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技术，主要有以下3大类。免疫荧光抗体技术免疫酶技术放射免疫分析,标记抗体,为什么要进行标记抗体？什么是二抗？,免疫酶标记技术,酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）免疫酶组织化学染色技术斑点-酶联免疫吸附试验,一 原理酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。,免疫酶相关的免疫制备技术抗体的制备标记用酶抗体标记ELISA：间接法，直接法，夹心法，竞争法免疫组化Dot-ELISA,免疫酶相关的免疫制备技术,免疫酶相关的免疫制备技术制备结合
2、物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,Preparation of Polyclonal Antibodies,Polyclonal antiserum is generated in animals(sheep,rabbits or goats)with the introduction of antigens into the animals bloodstream.The antiserum(ser
3、um from blood containing the desired antibodies)contains a mixture of antibodies,each of which may bind to different antigen binding sites(epitopes).Antiserum contains a mixture of antibodies.This mixture of antibodies are called ployclonal antibodies.An antigen that has multiple sites for antibody
4、binding is called a mutivalent antigen.,Preparation of Monoclonal Antibodies,Monoclonal antibodies are highly specific for a single epitope on a multivalent antigen.They are produced from a single cell line using hybridoma technology and mouse myeloma cell lines.,抗体纯化,沉淀法硫酸铵盐析辛酸法,层析法凝胶过滤层析离子交换层析免疫亲和
5、层析,硫酸铵盐析,取10 ml血清加10 ml生理盐水，加入20 ml饱和硫酸铵，终浓度为50%。4，3h以上，使其充分沉淀。离心弃上清，以10 ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵20ml。置43h以上.重复上述第二步过程12次。末次离心后所得沉淀物为-球蛋白，以PBS溶解至10ml装入透析袋。对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止,例：兔抗鸭IgG的提纯(辛酸硫酸铵沉淀法),实验结果,提纯的兔抗鸭IgG的SDS-PAGE,M：蛋白Marker 1：提纯的兔抗鸭IgG 2:兔血清,凝胶过滤层析主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层
6、析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。,离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。,免疫的亲和层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。
7、,免疫酶相关的免疫制备技术,用于标记的酶辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）葡萄糖氧化酶（glucose-oxidase，GO）,三、抗体的酶标记,过碘酸钠氧化法戊二醛法,过碘酸钠法,HRP是一种糖蛋白，过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基。此醛基很活泼，再与抗体蛋白的游离氨基结合，形成HRPCH2NHIgG。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原后，即生成稳定的酶标记物。,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+NH2抗体,O,O,O,N,N,抗体,抗体,H2O,N,抗体
8、,NaBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,戊二醛交联标记法,戊二醛它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。分为一步法和二步法：,一步法,将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。,二步法,先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合除去未与酶结合的多余戊二醛后再加入抗体(抗原)，形成酶戊二醛抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低
9、。,戊二醛交联法（二步法）,COH-（CH2）3-COH+NH2-酶,抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶,抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶,ELISA,免疫酶技术(enzyme immunoassay)：是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。,酶联免疫吸附试验ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶
10、(HRP)碱性磷酸酶（AP）。,常见的酶联免疫吸附试验,直接法间接法双夹心法竞争法,间接ELISA检测抗体,检测对象,ELISA的一般步骤（以间接ELISA为例）,二抗,包被抗原,一抗：待测血清,底物液,洗涤,封闭,洗涤,洗涤,终止,结果判定,操作步骤及步骤,包被：抗原非特异地吸附在ELISA板上,次日，用洗板液洗板3次（将洗板液加入每孔，1min后倾去），以洗去未包被的游离抗原。,抗原用包被缓冲液稀释100ul/孔,湿盒中，4过夜,酶标板,包被用缓冲液pH9.6碳酸盐缓冲液,ELISA板（条）,包被用抗原的种类,包被抗原的选择是间接ELISA方法建立的关键。常用的包被抗原：克隆表达及纯化的蛋
11、白全微生物：病毒和细菌纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白经过载体偶联的小分子半抗原,克隆表达及纯化的蛋白,选择合适靶点蛋白的可以鉴别强毒与弱毒的感染，以及感染与免疫引起的抗体。缺点：筛选合适的靶点基因困难。,全微生物抗原：病毒和细菌,包被前，均需要灭活处理。病毒个体较小，可以直接包被。细菌个体较大，包被前需要对ELISA板进行致敏，如利用戊二醛。缺点是抗原成分比较复杂，交叉反应多。,纯化的微生物组分：荚膜多糖、天然蛋白,缺点：荚膜多糖的提纯步骤多，难以质控。天然蛋白纯化难以达到理想纯化，而且产量有限。,经过载体偶联的小分子半抗原,Hapten:Hapten is a small molecu
12、le which is not antigenic in itself but when attached to a large molecule can stimulate the formation of antibodies.Carrier:Carrier is an immunogenic substance that,when coupled to a hapten,renders the hapten immunogenic.缺点：制备困难,封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后
13、的步骤中干扰物质的再吸附。一般封闭的时间为37度2小时封闭可以用BSA、小牛血清、明胶、脱脂乳等。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,加入一抗,一抗即需要检测的血清一抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：100-400
14、37度作用：一般为1-2小时，然后洗涤,加入酶标二抗,什么是二抗？SPA为什么可以作为哺乳动物广谱性的二抗使用？二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：1000-10000作用一般为1-2小时洗涤,显色,HRP的两种底物：OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定。最适吸收波长为450nm。,AP的底物：磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。,酶反应终止液,常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积
15、而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。AP的终止液用NaOH,读数和结果判断,定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。定量是在用酶标仪测出OD值后用公式计算，如P/N值大于2.1也可以用试剂盒中要求的方法进行判定,酶标仪,ELISA检测抗原,Ag+Ab*Ag-Ab*,夹心ELISA检测抗原,检测对象,ELISA检测抗体,检测对象,夹心法的适应范围？建立一种夹心法检测病毒颗粒的ELISA方法。,竞争ELISA检测抗原,竞争,竞争法的适应范围？建立一种竞争法检测小分子抗原的的ELISA方法。,免疫组化,免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗
16、体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。,Direct method,免疫组化(三步法)操作步骤,石蜡切片脱蜡至水。3%过氧化氢室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟2次5-10%正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液，37 孵育 1-2 小时或 4 过
17、夜。PBS 冲洗，5 分钟 x3 次。,滴加适量 标记二抗 工作液，37 孵育 10-30 分钟。PBS 冲洗，5 分钟 x3 次。滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液，37 孵育 10-30 分钟。PBS 冲洗，5 分钟 x3 次。显色剂显色 3-15 分钟（DAB 或 NBT/BCIP）自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。,Indirect method,Fluorescence Method,Texas Red,Rodamin,Cy3,AMCA,FITC,Cy2,免疫组织化学的临床应用,恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断确定转移性恶性肿瘤的原发部位对某类肿瘤进行进一步的病理分
18、型软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定,Dot-ELISA斑点酶联免疫吸附检测,纤维素薄膜(NC)作固相载体，代替了聚苯乙烯反应板，因建立Dot-ELISA的原理与常规ELISA相同，故常规ELISA可用Dot-ELISA代替，用于抗原、抗体的定性和定量等方面的检测。与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：,抗原包被将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，彻底干燥。封闭将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37感作1530分钟。加被检血清37反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次13分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。,加酶标抗体，37反应一定时间后，用洗涤液洗三次 显色加入新鲜配制的底物液,加蒸馏水洗涤终止反应 结果判定以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应,谢 谢,
