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1、临床基因扩增检验质量控制,医疗机构临床实验室管理办法（卫医发200673号）医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194号）医学实验室质量和能力认可准则 ISO15189(CNAS-CL02)医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的指南（CNAS-GL26）,实验室设置要求,四个区域（试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区）必须是互相独立的各区间不能直通，应有缓冲间应有充分合理的空间、良好的照明、通风和空调设备(不能使用中央空调)标本制备区有生物安全柜、冲眼器除移动紫外灯外，各工作区域内应有固定于房顶的紫外灯传递窗,实验室管理,进入和使用实验室各区域应有明确的限
2、制和控制，防止患者和其他非相关人员的随意进出 不同工作区域内的设备、物品不得混用,临床基因扩增检验质量控制,分析前患者准备、标本（采集、运送、验收、保存）、医生报告单申请分析中样本分样、仪器、核酸提取、核酸扩增、产物分析、检测的有效性判断分析后试验报告、报告传递、结果的接收、结果的审核、结果解释,标本,标本采集时间对扩增检测结果的影响标本的类型和采集量采样及运输容器采样质量的评价标本采集中的防污染,标本采集时间,1、血清（浆）：无特殊要求2、如用泌尿生殖道分泌物做CT、NG项目：应在抗生素应用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗生素，应于下次抗生素应用前采集。3、如用痰做TB：应在抗结核药物应
3、用前或停药两周后采集标本，如不能停用抗结核药物，应于下次抗结核药物应用前采集。因为PCR方法所检测的靶物质为核酸，不受标本生物活性的限制，对于已经死亡的病原体仍可检测出来，即感染后在药物治疗有效的情况下，患处仍会有少量已死亡的病原体存在。,标本采集量,标本的类型和采集量应根据所测病原体而定。一般来说，如果样本的量对病原体培养够用的话，则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测。,采样容器,采样所用的抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。如全血、骨髓和血浆标本，用EDTA抗凝，不使用肝素，因其是 Taq酶的强抑制剂，且在核酸提取过程中很难完全去除。使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经
4、高压灭菌，以使可能存在的RNase永久性失活。,标本验收、拒收,血液标本：溶血、严重脂血等应拒收泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般25个。,标本运送,实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件（温度、时间）作出相应规定。靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送，建议采集后8h之内送至实验室；靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验室；所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至实验室前，均应放28临时保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应
5、立即送检。,标本保存,靶核酸(尤其是RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要（避免反复冻融）靶核酸为DNA的标本2-8保存1-3天，靶核酸为RNA的标本应20下保存20下保存1个月70以下可长期保存如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本，可于10TE缓冲液mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)2-8下保存。用于RNA扩增分析的样本，则应于上述 TE缓冲液中-70保存。,标本接收,标本接收建议在三个测定区之外接收的标本应收集在原始容器中，不能接受从其他检测如生化、免疫检验等分出来的标本，因其有较大的发生标本间污染的可能性,标
6、本处理,血清（浆）：应1小时内分离血清，抗凝后4小时内分离血浆，然后转移至1.5ml灭菌离心管中保存。若血清分离不充分，可1500rpm离心5min。如甘油三酯含量超过6mmol/L或肉眼可见血清/血浆呈白色浑浊状的标本，应413 000rpm离心15min,吸取下层清亮血清或血浆转移至1.5ml灭菌离心管中保存 泌尿生殖道分泌物一次性采样管（含保养液）配套棉拭子（不含保养液）痰液结核分枝杆菌DNA检测标本：用4%NaOH摇匀，室温下放置30分钟左右液化，转移至1.5ml灭菌离心管，离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化时不能加热，液化时间不能过长。非结核分枝杆菌DNA检测标本：痰标
7、本在室温悬浮于灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块黏状物下沉，取上清离心，去上清，留沉淀用于核酸提取。切记不能用NaOH液化痰标本。,实验室仪器设备,分册建立仪器档案定期维护保养定期校准或检定（校准周期、校准单位、校准参数、合格的校准报告）,需校准的仪器,冰箱温度、温湿度计、移液器、恒温金属浴、生物安全柜、高速冷冻离心机、扩增仪、杂交仪,扩增仪,结构：温度控制及导热系统、光路系统、检测系统 维护：75%乙醇定期清洁热盖和反应槽或孔 用无水乙醇清洁光路部分校准：校准周期：定期校准、仪器搬动 校准参数：光路部分、背景荧光、温控部分（温度准确度、均一性、温度升降速率）,恒温金属浴,维护：75%乙醇
8、擦拭加热孔校准：温度准确度（应涵盖试验过程中所涉及的温度）孔间温度的均一性（自校应规定测定孔的选择、测量时间、各孔温度偏差允许范围）,移液器,维护：75%乙醇擦拭校准：校准周期、外校（厂家、计量所）、校准量程内部校准-参照定量、可调移液器试行检定规程(JJG646-90)，注意环境的要求、校准点涵盖试验过程中所涉及的量程,生物安全柜,清洁:75%乙醇擦拭,不得用次氯酸钠溶液清洁检定：有资质的第三方检测机构检定参数：高效过滤器完整性、流入气流流速、下降气流流速、气流模式,高速冷冻离心机,维护保养：75%乙醇擦拭校准：转速、温度,耗材、试剂,耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检试剂盒的质检 包
9、括外观质检和性能质检 选择或更换试剂品牌：试剂性能评估 更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率,更换试剂批号质检,设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照试剂不合格 1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。3)阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。试剂合格 阴性对照无扩增、低值阳性质控品检出,室
10、内质量控制,目的 监测和控制实验室常规工作的精密度，即实验室测定的批内和批间重复性IQC结果决定了实验室即时测定结果的可靠性和有效性,质控品来源及使用,来源:第三方、试剂盒自带、自备使用:1)冻干质控品复溶时，要确保所用溶剂的质量；当溶剂为焦碳酸二乙酯（DEPC）水时，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。因DEPC是一种潜在的致癌物质.它可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制物。2)冻干质控品复溶时，所加溶剂的量要准确 3)冻干质控品复溶时应轻轻摇匀，切忌剧烈振摇,质控品设置、数量,定性检测已知弱阳性质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，监测核酸提取和扩增检测的有效性已知阴性
11、质控样本（基质与待测标本相同）：至少带1份，判断核酸提取过程中是否发生污染(实验室的以前扩增产物的污染、标本间的交叉污染、强阳性标本气溶胶经加样器导致污染、强阳性标本经操作者手导致污染 翻盖离心管在较高温度温育时盖子崩开、扩增反应试剂的污染 定量检测已知高、中、低质控品（基质与待测标本相同）已知阴性质控样本（基质与待测标本相同）,板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。,质控品位置,室内质控品在扩增仪中的排列顺序：不宜固定位置,尽可能监测每一个孔扩增有效性板上杂
12、交和膜上斑点印迹杂交的质控：在板上杂交和斑点杂交时，阳性和阴性质控应该在同一板或膜上与病人标本平行进行分析，这可排除不同反应中因使用不同杂交条件所致的对结果的错误解释。,质控品均值建立,暂定均值的建立：20d内得到20个数值，或至少在5d内，每天作不少于4次重复检测获得20个数值。对数据进行离群值检验（剔除超过3s外的数据），计算出均值，作为暂定均值。若使用定值质控品，均值必须在实验室内使用自己现行的测定方法进行确定，质控品说明书上的原有标定值只能作参考。常规均值的建立：以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积平均数作为质控品有效期内的常规均值，并以此作为以后室内质控图的均
13、值。,常用质控规则的符号及定义,符 号 定 义12S 一个质控测定值超出2s控制限。13S 一个质控测定值超出3s控制限。22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。R4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间 的差值超出4s控制限。41S 四个连续的质控测定值同时超出+1s或1s控制限。10X 十个连续的质控测定值同时处于均值的同一侧。,统计质控方法,Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则质控 方法“即刻法”质控方法,Levey-Jennings质控图方法,根据常规条件下的变异（RCV）计算中的平均值和SD确定
14、质控线，一般以X2S为告警限，X3S为失控限，将所得质控结果标在一张质控图上，简单明了。但如果以X2S为失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以X3S为失控限假失控概率低，但误差检出能力不强。,由12S，13S，22S，R4S，41S，10 等规则组成，其中既有对随机误差检出敏感的，也有对系统误差敏感的。结合在一起，假失控和假告警概率低，误差检出能力增强，大大提高了失控的检出率。在实践中13s、R4s规则常检出随机误差，而22s、41s和10 x质控规则检出系统误差。,Westgard多规则控制方法,1)12S 为警告规则，不是失控规则。若本批检验没有出现控制结果超出控制线，表示本批结果没有问
15、题，在控，可以发出报告。若本批检验有1个控制结果超出（不包括正好在限值线上的结果）2S控制线，表示本批结果可能有问题，符合12S规则。是一个警告，但不是失控。,12S,12S规则示意图,失控的表现如下：2）13S 即这个控制值不仅超出2S控制线（符合12S规则），而且还超出了3S限值（符合13S规则）。这是在检验中很少发生的（概率约为0.3%），是一个检出随机误差的失控规则。,13S失控规则,13S失控规则示意图,3）22S 有两种表现：l同批两个控制品结果同方向超出2S限值。或同一控制品连续两批控制结果同方向超出2S限值。属系统误差失控。,22S失控规则,22S失控规则示意图,22S失控规则
16、,4）R4S 在同一批中两个控制结果差超出4S范围，其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S限值。或其中一个超出了1.5S，另一个超出了2.5S限值属随机误差过大，为失控。,R4S失控规则,R4S失控规则示意图,5）41S 有两种表现：包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前3次结果均和这个控制结果在同方向超出+1S或 1S范围。l 包括出现警告在内的这个超出2S的控制结果，这个控制品前1次结果，均同方向超出+1S或1S范围；另一个控制品的这两次结果也是同方向超出+1S或1S范围。属系统误差失控。,41S失控规则,41S失控规则,41S失控规则示意图,6）10 连同出现12S
17、警告的这个结果，另外还有两个控制品的结果，在前几批及本批结果中，有连续10次在的一侧。属系统误差失控。,失控规则示意图,失控规则,“即刻法”质控方法,只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在。将连续的质控测定值按从小到大排列，即x1、x2、x3、x4、x5、x6、xn（x1为最小值，xn为最大值）；计算均值和标准差(s);按下述公式计算SI上限和SI下限值；SI上限=（x最大值 均值）/s SI下限=（均值 x最大值）/s将SI上限和SI下限值与SI值表中的数值比较。,SI值表,n n3s n2s n n3s n2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.4
18、6 13 2.61 2.3 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56,质控结果的判断,SI上限和SI下限值均 n3s对应的值时，说明该质控测定值的变化已超出3s，属“失控”。,即刻法优缺点,优点：对于检测项目开展次数少的实验室可进行质控缺点：繁琐 初始阶段的质控数据，前3个质控值的CV对随
19、后的结果影响大。,临床基因扩增检验室内质量控制操作,前20个数据使用即刻法，可对第320个数据进行质控判断第21个数据开始使用常规质控方法进行质控判断,失控原因分析阳性质控样本常见的失控原因,核酸提取中的随机误差。如核酸提取中的丢失、有机溶剂的去除不彻底、标本中扩增抑制物的残留等。仪器的问题。如扩增仪孔间温度的不均一性、孔内温度与所示温度的不一致性等。试剂的问题。如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等。,失控原因分析阴性质控样本的失控原因,扩增产物的“污染”临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉“污染”.,避免基因扩增检验假阳性结果的措施,严格的实验室分
20、区使用带“滤芯”的吸头设立“阴性”质控（与标本同时处理）使用防“污染”（含UNG）的PCR试剂临床“假阳性”问题：病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡，但PCR仍可为阳性，故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测。,避免基因扩增检验假阴性结果的措施,避免由于来自于标本的血红蛋白、肝素、某些激素或来自标本处理中的去垢剂、有机溶剂的抑制作用的措施：纯化核酸；标本重复双份测定；稀释标本定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一致性进行检查和校准,注意事项,在PCR试剂准备区配置反应混合液，先将dNTP、引物、酶和缓冲液混合后，再分装；配制反应体系时，应注意移液器的使用方法，所有的液体都要缓慢加至管
21、底，不要加至管壁，所有液体的混匀要用振荡器进行，不能用移液器吹打，反应体系配制完毕后低速离心数秒，避免产生气泡分装的试剂注意冷藏，防止酶试剂失活及有机大分子降解优先选择含UNG的试剂盒试剂经充分溶解后混匀，离心后再开盖，保持试剂均匀性扩增管、样品处理管及吸头等实验用品，均需高压灭菌标本处理应在标本制备区指定的生物安全柜内进行，实验前应打开风机5-10min，待柜内空气净化并气流稳定后再进行实验操作为防止标本间交叉污染，在打开离心管前宜短暂离心,注意事项,如遇吸弃上清步骤的提取方法，离心时应注意离心管的方向，吸弃上清时不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。标本处理严格按照试剂说明书进行操作，应
22、做到处理时间充分，保证标本中的DNA或RNA完全释放；将提取的核酸加到反应体系中后，应将纯化好的剩余核酸样本冻存，以免在扩增检测时出现意外需要重新检测。在结果确定后再将这些样本按生物污染废弃物进行处理。扩增条件一致的不同检测项目同时扩增时不得使用同一套标准品。扩增后的扩增管不能在扩增及产物分析区打开处理，应用一次性手套包好远离PCR实验室的洗涤间消毒处理；工作结束后，必须立即对各工作区进行清洁,结果判断,在判断结果时，应先对扩增的荧光信号作出定性判断，然后再进行定量分析，避免一些非特异荧光信号对结果分析的干扰。基线值（阈值）设定：遵从厂商规定,如罗氏LightCycler仪器基线设定,在阴性对
23、照线上 与所有扩增曲线相交相交点在曲线的平滑区 位置尽可能,总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增效率越高，试剂灵敏度表现会越好。基线，图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。而扩增效率相近与否，反应在扩增曲线图上就是曲线的平行性。低浓度曲线
24、指数期明显，一方面不易出现假阴阳性误判，另一方面说明灵敏度高。,实验结果有效性判断标准,标准曲线平滑均匀，斜率、截距和相关系数等参数的数值允许变化范围均应在试剂制造商推荐的范围内。阴、阳室内质控检测结果均处于在控状态。以上几项标准均达到要求后，当日实验有效，可以发放报告。否则，本次实验无效，全部标本应重新检测。,实验灰区标本的处理,定性测定中处于实验灰区的标本应重复检测一次，灰区范围的确定及结果报告应遵从各试剂制造商推荐的要求。复星CT：38Ct值40为检测灰区，建议重复检测2次。如果检测结果至少1次为Ct40判断为阳性，否则判为阴性。达安CT:ABI7000：27Ct值30为检测灰区，重复检
25、测1次。如重复试验Ct值30判为阳性，否则判为阴性。Roche LightCycler：37Ct40为检测灰区，重复检测1次。如重复试验Ct值40判为阳性，否则判为阴性,结果报告,定性检测 定性检测的结果报“阴性”或“阳性”。但由于目前国内商品试剂盒的灵敏度多为500-1000IU/ml，在报告结果时应告知临床医生方法的局限性。定量检测 1）结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告。2）样本未出现扩增曲线，则报告为“低于检测下限”，不能报告为“0”或“阴性”。如果低于检测下限，但又有扩增曲线，则应重新检测，仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限”。3）结果高于检测上限，则报告“高于检测上限”
26、，如果需要精确定量结果，则应用阴性血清（浆）将样本进行100-1000倍稀释后再重新进行检测，结果乘上稀释倍数；或将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。,结果解释,临床可以肺结核患者痰涂片阴性，而TB菌PCR阳性或时阴时阳，可能患者为初起病间断排菌且排菌量不大所致；或经抗结核治疗后，常有矛盾报告培养（-）、PCR（+）较多，因为只要有TB靶片段存在，PCR即可阳性，而测得阳性，不一定有活菌，加之病情与菌量不一定成正比。HBV（及HCV）感染在抗病毒治疗过程中，可出现HBV-DNA(及HCV-RNA)阴转情况，有时停药后又转阳。药物是否能彻底清除病毒还要根据肝脏酶学、病毒血清学标志物及核酸结果综合考虑，仅有核酸阴转而其他指标不改变并不能证明临床痊愈。另外，PCR检测结果阴性并不能排除样本含有病原体，只能说明含有的病原体浓度低于本试剂的检测下限,室间质评,目的:监测检测结果的准确性PCREQA评价方式:组均值3SD、组均值0.5log10和溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值0.4 常规标本对待反馈结果结果分析,无室间质评的检测项目应进行实验室间比对或用其他方法验证其检测结果的可靠性,谢 谢,
