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1、第四章酶工程制药,第一节概述第二节酶的来源与生产第三节酶和细胞的固定化第四节固定化酶和固定化细胞的反应器第五节酶工程在医药工业的应用第六节酶工程研究的进展,新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生,第一节概述,生物技术,医药生物技术农业生物技术工业生物技术环境生物技术材料生物技术.,用生物或生物分子机器生产产品和解决问题,生物技术的具体应用,生物技术产业化的三个浪潮,医药生物技术:1982年重组人胰岛素上市 农业生物技术:1996年转基因大豆、玉米、油菜相继上市 工业生物技术:世纪之交聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市,工业生物技术-迈向发达国家之战略,工业生物技术,含意：在工业规模的生产过程中使用或部
2、分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化,工业生物技术是生物技术的重要组成部分,工业生物技术发展空间,提升传统产业生物能源环境生物技术生物材料,底物,生物反应器,检测控制仪表,培养基,（灭菌）,经加工原料,酶,细胞,生物催化剂（游离或固定化）,机械能,除菌,空气,产品提取纯化,副产品产品废物,热能,原材料,营养物,典型工业生物技术过程,核心技术？,生物催化（Biocatalysis),利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。,生物转化（Biotransformation
3、),生物催化,化学工业,发酵工业,轻工业,采矿,医药,食品,能源,材料,生物安全,环境,生物催化是工业生物技术的核心技术,以生物催化法合成的主要产品,趋势判断和需求分析,生物催化剂在精细化学品市场中呈现强劲的增长势头。到2020年，通过生物催化技术，将实现化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染扩散减少30%。,趋势判断和需求分析,目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具。Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等许多跨国公司都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。,生物催化发展的主要推
4、动力,新产品需求(社会压力)-健康：医药、检测-日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料环境(法律法规压力)绿色化学、能源、温室效应新发现或基础研究(技术压力）基因工程/定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学 得益/成本降低(商业压力)-生物分离,The Biocatalysis Cycle,生物催化剂工程的目标,开发生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低开发生物催化剂工具合：催化反应更广泛，功能更多样 改善性能:稳定性,活性，溶剂兼容性开发分子模型:新酶的快速重新设计创造新技术:用于新生物催化剂的开发,生物催化剂发展的工业展望,生物催化剂工程技术瓶颈,对生物催化剂作用机理缺乏深入的认识对次级
5、代谢产物代谢途径（包括途径间相互关系）缺乏理解细胞工程化的方法十分有限（即代谢工程）生产酶和辅因子的成本过高,当前生物催化的研究热点,新酶或已有酶的新功能的开发根据已有底物开发新的酶反应利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系体内或体外合成的多酶体系克服底物和产物抑制精细化工品或医药合成技术的放大辅因子再生生物催化剂的修饰生物催化剂的固定化,生物催化剂高效生产与催化功能研究,强化微生物细胞培养与发酵的调控措施，研究酶的诱导策略实现生物催化剂的自主和规模生产分析生物催化剂所催化的特定基团开辟全新的生物催化反应,什么是酶？,
6、酶是蛋白质酶是催化剂酶是具有催化作用的蛋白质,什么是酶促反应？,由酶催化的生物化学反应,酶学研究简史,1878 德国的Kuhne 定义Enzyme 原意为在酵母中1926 美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶（1947年诺贝尔奖）1970 美国的Smith 发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。酶工程诞生1986 美国 核酶发现获得诺贝尔奖,国际市场酶制剂销售额比例 2001年工业酶制剂的世界市场约为15亿美元用于制药工业与精细化学工业约1.2亿1.5亿美元,一酶的分类：,1氧化还原酶2转移酶3水解酶4裂合酶5异构酶6连接
7、酶（合成酶）7核酸酶（催化核酸）,1氧化还原酶(Oxidoreductase),包括脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等,2转移酶(Transferase),包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等,3水解酶(Hydrolase),脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶,4裂合酶(Lyase),这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。,5异构酶(Isomerase),此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等,6连接酶（合成酶）(Ligase
8、 or Synthetase),这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。,7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme,核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,酶用于生物催化的概况,酶与酶促反应的特点,易变性蛋白质结构易受环境变化而改变催化效率高专一性强特定的酶催化特定的反应,酶的特点,反应条件温和生物化学反应在常温常压下进行酶的催化活性受到调节与控制,酶促反应的特点,酶的聚集方式,酶1,1.松
9、散排列 酶在细胞中各自以可溶的单体形式存在，彼此没有结构上的联系。反应时酶是随机扩散，催化效率不高。（如糖酵解历程）,酶2,酶3,酶4,酶5,酶的聚集方式,2.簇式排列 几种酶有机地聚集在一起，精巧的镶嵌成一定的结构，定向转移，形成多酶复合体。催化效率高。（如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶复合体）,酶2,酶3,酶1,酶4,酶6,酶5,酶的聚集方式,3.与生物膜结合 一种结构更高的多酶复合体，酶整齐的排列在生物膜上。催化效率最高。（如呼吸链）,酶1,酶2,酶4,酶5,酶3,酶的组成,酶的化学组成 1.单成分酶（单纯蛋白质/简单蛋白质）2.双成分酶（结合蛋白质）(1)蛋白质部分（酶蛋白）稳定辅因
10、子(2)非蛋白质部分（辅因子）起催化作用 小分子有机化合物 金属离子 全酶=酶蛋白+辅因子,酶的结构,结合部位,酶,活性中心以外的必需基团,其它部分,必需基团,活性中心,催化部位,酶活性中心示意图,酶的催化作用机理,中间产物学说酶作用专一性机理 1.锁钥学说 2.诱导契合学说酶受底物诱导而变形 3.张力学说（应变效应）底物变形以适应酶酶作用高效性机理-影响酶高效性的因素 1.邻近定向效应 2.应变效应 3.亲核催化/亲电催化（共价催化）4.酸碱催化 5.微环境的影响,酶催化作用的中间产物学说,E+S ES P+E（酶）底物）（中间物）（产物）（酶）中间产物存在的证明：H2O2+过氧化物酶（H2
11、O2 过氧化物酶）（褐色）（红色）645587548498nm 561550nm（H2O2 过氧化物酶）+AH2 过氧化物酶+A+2H2O（红色）（褐色）,锁 钥 学 说,诱导契合学说,邻 近 定 向 效 应,综上所述：酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形（张力学说）使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核亲电催化、一般酸碱催化或金属离子催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速迅速进行。,酶催化作用机理,影响酶促反应的因素,一.底物浓度S,四.pH,
12、二.酶浓度 E,三.温度pH,五.激活剂（1）激活剂(activator)凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性提高的物质，通称为激活剂。（2）激活剂(activator)种类 大部分是无机离子或简单的有机小分子。如Mg2+是多种激酶和合成酶的激活剂；Cl-是唾液淀粉酶最强的激活剂。一些小分子有机物，如抗坏血酸、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等，对某些巯基酶具有激活作用。这是由于这些酶需要其分子中的巯基处于还原状态才具有催化作用。还有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)。它是金属螯合剂，能除去重金属离子，从而解除重金属对酶的抑制作用。,六.抑
13、制剂.抑制剂(inhibitor)凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。竞争性抑制 可逆抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制 不可逆抑制,竞争性抑制作用：此类抑制剂一般与酶的天然底物结构相似，可与底物竞争酶的活性中心，从而降低酶与底物的结合效率，抑制酶的活性。这种抑制作用称竞争性抑制作用(competitive inhibition)。特征：a.由于抑制剂与酶的结合是可逆的，抑制强度的大小取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑制剂与底物浓度的相对比例。b.通过增加底物浓度可降低或消除抑制剂对酶的抑制作用。,竞争性可逆抑制图示,非竞争性抑制作用 有些抑制剂可与酶活性中心以外的必需基团
14、结合，但不影响酶与底物的结合,酶与底物的结合也不影响酶与抑制剂的结合，但形成的酶-底物-抑制剂复合物(ESI)不能进一步释放出产物，致使酶活性丧失。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用(non-competitive inhibition)。,非竞争性可逆抑制图示,不可逆抑制作用不可逆抑制作用(irreversible inhibition)的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行结合，一经结合就很难自发解离，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制。其实际效应是降低反应体系中有效酶浓度。抑制强度取决于抑制剂浓度及酶与抑制剂之间的接触时间。按其作用特点，不可逆抑制有专一性及非专一性之分。,专一性不可
15、逆抑制剂此类抑制剂专一地与酶的活性中心或其必需基团共价结合，从而抑制酶的活性。例如：有机磷杀虫剂能专一地作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而破坏酶的活性中心,导致酶的活性丧失。有机磷杀虫剂的杀虫机理：当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，胆碱能神经末稍分泌的乙酰胆碱不能及时分解，过多的乙酰胆碱会导致胆碱能神经过度兴奋，使昆虫失去知觉，人和家畜产生多种严重中毒症状，甚至死亡。非专一性不可逆抑制剂此类抑制剂可与酶分子结构中一类或几类基团共价结合而导致酶失活。它们主要是一些修饰氨基酸残基的化学试剂,可与氨基、羟基、胍基、巯基等反应。例如：烷化巯基的碘代乙酸、某些重金属(Pb2+、Cu2+、Hg
16、2+)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆结合。,什么是酶工程,是酶学与工程学相互渗透结合的产物工程学设计安装施工生产从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用篺的技术。,酶工程,酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程有密切的联系，尤其与发酵工程的联系更加密切,酶工程的研究内容,酶的分离、提纯、大批量生产及新酶的开发应用酶和细胞的固定化及酶反应器酶生产中基因工程技术的应用及基因修饰酶酶的分子改造及化学修饰，以及酶的结构与功能关系有机相中酶反应酶的抑制剂、激活剂开发与应用抗体酶、核酸酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计与合成,第二节酶的来源与生产,酶的来
17、源微生物、动物与植物酶的生产,生产菌：产酶量高；非致病菌；稳定而不易退化；能利用廉价原料常用生产菌：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、曲霉、青霉、木霉等,酶制剂的来源，有微生物、动物和植物，但是，主要的来源是微生物。由于微生物比动植物具有更多的优点，因此，般选用优良的产酶菌株，通过发酵来产生酶。为了提高发酵液中的酶浓度，选育优良菌株、研制基因工程菌、优化发酵条件。工业生产需要特殊性能的新型酶，如耐高温的淀粉酶、耐碱性的蛋白酶和脂肪酶等，因此，需要研究、开发生产特殊性能新型酶的菌株。酶的分离提纯技术是当前生物技术“后处理工艺”的核心。采用各种分离提纯技术，从微生物细胞及其发酵液，或动、植物细胞及其培
18、养液中分离提纯酶，制成高活性的不同纯度的酶制剂，为了使酶制剂更广泛地应用于国民经济各个方面，必须提高酶制剂的活性、纯度和收率，需要研究新的分离提纯技术。,酶的分离提纯及活力测定,酶的分离提纯选材破碎抽提分离及提纯保存酶活力单位酶活力及酶促反应速度 V=P/t酶活力单位(U 或 IU；Katal 或 Kat)酶的比活力 活力单位数(U)/酶蛋白(mg)酶的转换数 Kcat=Vmax/Et,第三节酶和细胞的固定化,为什么要固定？溶液中的酶只能使用一次，造成浪费产品分离纯化困难溶液酶不稳定易变性失活,现代工业化生产的特点？,1953年，Crubhofer和Schleith将胃蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶和
19、核糖核酸酶等结合在重氮化的树脂上，实现了酶的固定化。1969年，日本千佃一郎首次应用固定化氨基酰化酶大规模生产L氨基酸。从此以后固定化酶研究十分活跃，进展很快。现在、已有十多种固定化酶用于工业生产。例如：利用固定化葡萄糖异构酶生产高果葡萄浆；利用固定化青霉素酰化酶生产6氨基青霉烷酸；利用固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶等。1973年干佃郎首次利用固定化大肠杆菌细胞生产L天冬氨酸。从此以后，微生物细胞固定化研究十分活跃，进展更快。现在，已有愈来愈多的固定化微生物细胞用于工业生产.例如：固定化大肠杆菌细胞生产6氨基青霉烷酸；固定化产氨短杆菌细胞生产L苹果酸；固定化假单孢菌细胞生产L-丙氨酸；固定化链霉菌
20、细胞生产果葡糖浆；固定化酿酒酵母细胞生产酒精等但是，大多数固定化酶或细胞的应用研究，尚处于实验室研究阶段或小试生产阶段，向待进一少研究。,固定化酶的定义限制或固定于特定空间位置的酶。不易随水流失而又能发挥催化作用的酶制剂固定化酶的特点属于修饰酶；可以多次使用；产品易于分离纯化；反应条件易于控制可实现转化反应的连续化与自动控制；酶的利用效率高；比水溶性酶更适于多酶反应。,一、固定化酶的制备,酶和细胞的固定化方法,载体结合法,交联法,包埋法,物理吸附法,离子结合法,共价结合法,网格法,微囊法,热处理（细胞）,酶和细胞的固定化模式图,交联法酶的固定化,酶和细胞的常用固定化载体,二、固定化细胞的制备,
21、固定化细胞的定义限制或固定于特定空间位置的细胞。与固定化酶全称为固定化生物催化剂。固定化细胞的特点无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状态，回收率高；细胞内酶比固定化酶稳定性高；细胞内酶的辅助因子可以自动再生；细胞本身具有多酶体系，可以催化一系列反应；适于催化小分子底物；抗污染能力强。,载体结合法包埋法交联法无载体法：靠细胞自身的絮凝作用，通过助凝剂或选择性热变性的方法实现固定化。,固定化细胞的制备,1.固定化方法的选择固定化酶应用的安全性固定化酶在操作中的稳定性。固定化的成本2.载体的选择常用的、廉价的、质量有保障的,三、固定化方法与载体的选择依据,固定化方法与特性比较,四、固定化酶与细胞
22、的形状与性质,1.固定化酶与细胞的形状颗粒状、纤维状、膜状、管状。2.固定化酶与细胞的性质酶活力的变化酶稳定性的变化操作稳定性、贮存稳定性、热稳定性、对蛋白酶的稳定性酶学特性的变化底物专一性、最适pH、最适温度、米氏常数、最大反应速度,五、固定化酶活性的测定方法,1.分批测定法是固定化酶的搅拌或振荡条件下进行测定的方法，与测定天然酶活相似。2.连续测定不管是分批反应器、连续搅拌反应器，都可以从其中引出反应液到流动比色杯中进行分光光度分析测定酶活。,第四节固定化酶和固定化细胞的反应器,用于酶催化反应的装置叫酶反应器。溶液酶和固定化酶均可用。固定化酶和固定化细胞能否应用于工业生产，在很大程度上取决
23、于酶反应器的的设计和选用，性能良好的反应器可以大大提高生产效率。,一、反应器的类型与特点,几种反应器比较,间歇式搅拌罐反应器：固定化酶很少用于此类反应器。连续流动搅拌罐反应器：搅拌过程可能损坏固定化酶。填充床反应器：目前使用最多的类型。流化床反应器：用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物。循环反应器：较高的转化率，反应底物可以是不溶性物质。连续流动搅拌罐-超滤膜反应器：将酶截流，将大分子底物分开。其他反应器：如淤浆反应器、滴流床反应器、气栓式流动反应器等。,二、反应器选择的依据,根据固定化酶的形状根据底物的物理性质根据酶反应的动力学特点根据外界环境对酶稳定性的影响根据操作要求及反应器费用,各种反应
24、器的选择依据,BSTR和CSTR：结构简单、操作方便、适用于粘性或不溶性底物，底物抑制时有较高的转化率，但产物抑制时转化率会降低。PFR：具有较高的转化效率，产物抑制时，其转化率明显优于BSTR和CSTR；不适用不溶性的或粘性的底物。FBR：物质交换与热交换特性较好，不引起堵塞，可用于不溶性或粘性底物，但消耗动力大，不易直接放大。CSTR/UFR：适用于水溶性酶和不溶性或粘性酶，但使用时间不能太长。RSR：转化效率高，但成本高。,固定化方法与特性比较,第五节酶工程在医药工业中的应用,一、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,青霉素G（V）绿青霉素酰化酶作用，水解除去侧链后的产物称为6-氨基青霉烷酸
25、（6-APA）,二、固定化酶法生产5-复合单核苷酸,RNA经5-磷酸二酯酶作用可分解为AMP、CMP、GMP及UMP。5-磷酸二酯酶存在于麦芽根中,三、固定化酶法生产L-氨基酸,化学合成法得到的氨基酸都是无光学活性的DL-外消旋混合体，必须拆分后才能获得L-氨基酸,第六节酶工程研究的进展,定义：用化学方法对酶分子进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。目的意义：提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、改变酶学性质（最适pH值、最适温度、KM值、催化活性和专一性等）、扩大酶的应用范围。,一、酶的化学修饰,糖及糖的衍生物：如右旋糖酐。高分子多聚物：如聚乙二醇、聚乙烯。生物大分子：如肝素、血浆蛋白质。双功能试剂：如戊二醛、二异硫氰酸。其他：如固定化酶载体、糖基化试剂。,常用的化学修饰剂,化学修饰的措施,修饰酶的功能基团酶分子内、分子间进行交联。修饰酶的辅助因子。酶与高分子化合物相结合。,二、酶的人工模拟,定义：根据酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。,模拟酶-环糊精,分子印迹指制备对某一特定分子具有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板,非共价分子印迹,Thank you,
