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1、如何利用检测项目助于MDS的克隆性分析？,内 容,MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用,1 MDS疾病的概述,是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病（AML）转化。,核出芽,核碎裂,核间桥,特点,骨髓增生异常综合征分类WHO2016版,关键词：病态造血 单系或多系 环形铁粒幼细胞,病态造血,MDS的病态造血细胞主要来自于恶性克隆。病态造血可以反映MDS的本质，但不是MDS所特有疾病诊断的根本，证明病态造血是MDS克隆所致,MDS 是不明原因导致的癌性造
2、血克隆逐渐扩增，引起的正常造血衰竭性疾病。,某种原因,抑制正常造血,癌性克隆,继续扩增,normal,MDS,AML,2 MDS疾病的本质,染色体与克隆性,至少2个细胞有同样的染色体增加或结构重排，或者至少3个细胞有同样的染色体丢失，方可确认存在1个异常克隆。人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）,血液肿瘤患者的染色体畸变常呈克隆性，此种克隆性明确提示疾病的恶性本质。,3 MDS的单克隆细胞群的标记,N Engl J Med 2012;366:1090-8.,基因突变的积累会导致正常细胞获得恶性克隆。从MDS阶段到sAML阶段分子克隆是一个演化的过程。（分子克隆的种类逐渐增加，各克隆的
3、所占比例也发生较大变化。）,基因突变与克隆性,4 MDS的单克隆性分析的重要性,维也纳诊断标准中明确提出染色体、基因突变克隆性分析的重要性,内 容,MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用,1 MDS患者的染色体异常,40-60%MDS患者具有非随机的染色体异常。,MDS中染色体异常及比例（WH0 2008）,2 染色体的诊断价值,难治性血细胞减少，遗传学异常,与MDS特异性较高的染色体核型包括:-7/7q-、-5/5q-、-13/13q-、11q-、12p-/t(12p)及平衡性易位如 t(11;16)、t(3;21)、t(1;3)、t(2
4、;11)等。,del(20q)、+8、-Y,当形态学证据不充足时,可以诊断为MDS,不能推测为MDS,当形态学证据不充足时,3 染色体的预后价值,染色体核型分析至少20个骨髓细胞的中期分裂象，阳性检出率低,骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）,4 染色体检测手段的要求,FISH对染色体检测阳性率可以达到50%，但是探针数量有限。,骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）,FISH检测,基因芯片技术,骨髓增生异常综合征中国专家共识（2014版）,单亲二倍体：是指一对同源染色体全部来自父亲或母亲。UPD分为遗传性和获得性两种，获得性UPD在癌症的发展过程起重要的作用。20%的MDS患者
5、表现为获得性UPD，获得性UPD可导致受累基因的纯合突变，在MDS患者中通常表现为MDS相关基因的纯合突变。,5 全基因组芯片,原理,Millions of locations available on each GeneChip array,The probes are all between 25 and 49 bp in length,Microarray:探针包埋在固相支撑物上提供丰富的生物信息,寡核苷酸探针客服了分辨率的局限:The DNA probes在25-80 bp长度间 在1.281.28cm上能够包含650w个生物探针 在检测CNV方面数据质量极高 可以发展成为能够检测非C
6、NV的突变,e.g.LOH,UPD and IBD区域.可以用于genotyping,基因芯片可检测染色体扩增/缺失/单亲二倍体,芯片检测结果提示,基因芯片在临床应用的意义,基因芯片可提高染色体异常检出率。MDS染色体异常的阳性检出率为78%，其中20%阳性异常为UPD；而染色体核型+FISH的检出率为59%。,Blood-2011-Tiu-4552-60,不同的预后分组的MDS患者结合基因芯片结果后，OS存在较大差异,MDS的诊断与鉴别诊断特异性诊断价值的克隆性证据寻找（如-7/7q-、-5/5q-、-13/13q-、11q-等。）以辅助MDS的诊断。与其他非克隆性疾病的鉴别诊断（AA、IR
7、P等）MDS的预后判断对染色体异常的全面检出，更能契合IPSS-R预后系统的分层评估。作为细胞遗传学的补充手段，提高染色体异常检出率。（单亲二倍体、缺失、扩增更高的检出率）,芯片临床应用时机,内 容,MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用,1987年首次报道MDS患者存在基因突变,基因突变里程碑式的进展,2011年报道：核型正常的MDS患者，近50%存在基因突变,2014年：MDS中国版专家共识将常见的几种基因突变纳入其中,基因突变=克隆性造血?,基因突变克隆性分析的关键,确定基因突变的致病性，是克隆造血的关键证据！,MDS相关基因突变检测
8、,突变位点,无临床意义,有临床意义,多态性,非多态性,胚系突变,获得性突变,会导致克隆性造血的点突变,确定胚系突变的临床意义：患者病因确定，调整治疗方案。造血干细胞移植供者筛查。患者的遗传咨询，及定期随访。,单核苷酸多态性（SNP）与非多态性位点突变的鉴别 SNP指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。胚系突变与获得性突变的鉴别 胚系突变：基因突变通过卵子和/精子传递，导致几乎所有的胚 胎细胞都存在相同的突变，这种突变可以代代相传。获得性突变：后天由于某种原因导致的体细胞发生的突变。,几个概念，助于理解何为致病性,基因突变克隆性分析的临床
9、应用,1 提示克隆性造血的存在，为诊断提供参考依据。,2017版NCCN指南明确提出：基因突变，可提示MDS的克隆性造血的存在。,对于无法确诊的MDS患者，基因突变的克隆性分析，可以提供辅助标准指标。,2 辅助疾病亚类的鉴别,MDS伴单系病态造血,MDS伴多系病态造血,MDS伴环形铁粒幼细胞,SF3B1基因突变，可作为MDS疾病亚型的分类。,3.1 SF3B1基因,SF3B1 基因定位于2q33，是RNA剪切因子常见的剪切因子有SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、等，这类基因的突变存在互相排斥性，即在同一例患者中几乎只出现其中1个基因突变,Yoshida et al.,Nature
10、,2011,3.2 SF3B1与环形铁粒幼细胞的相关性,Blood，2013（121）：260-269,血红素合成的基因表达异常,线粒体铁代谢异常,在MDS或MDS/MPN患者中，存在SF3B1基因突变时，出现伴有环形铁粒幼细胞的可能性为97.7%，而SF3B1基因不突变时，97.8%的可能性不会出现环形铁粒幼细胞。,3.1 SF3B1基因突变,MDS-RS,RARS,Rui Cui,et al.Leukemia Research.2012,36:1428,若存在SF3B1基因突变，提示预后较好。,3 辅助疾病的预后判断,Rafael Bejar.haematologica 2014;99(6
11、),在IPSS-R预后分级为极低危、低危、中危的患者，若存在 TP53,EZH2,ETV6,RUNX1,ASXL1突变中的任何一种，预后较差。,3.2 影响危险分级TP53,EZH2,ETV6,RUNX1,ASXL1,携带的基因突变数量和种类越多，疾病的预后分层越差，进展越快，转化为AML的几率越高。,3.3基因突变数量影响预后,Haematologica.2014 Jun;99(6):956-964.,MDS的病人同时存在许多表观遗传控制基因的突变,如ASXL1、DNMT3A、EZH2、IDH1、IDH2和TET2等。通过对这些基因突变的检测可进一步预测MDS是否会对去甲基化药物发生反应。,
12、4 临床指导用药,4.1去甲基化药物敏感性预测,骨髓增生异常综合征诊断与治疗专家共识（2012版）,4.2 TP53与来那度胺,诊断与鉴别诊断,预后判断,用药指导,环状铁粒幼细胞 与SF3B1MDS 基因突变分析套餐,IPSS-R+MDS 基因突变分析套餐,去甲基化药物：ASXL1、DNMT3A、EZH2、IDH1、IDH2和TET2,来那度胺治疗：TP53基因突变,免疫制剂治疗（ATG、环孢素）：HLA-DR15基因检测,基因突变小结,5 临床应用小结,内 容,MDS与克隆性染色体异常与MDS的克隆性基因突变与MDS的克隆性基因芯片与基因突变的联合应用,联合二者综合分析,基因突变,基因芯片,
13、某些基因位点突变分析,染色体的高分辨分析，可检出染色体扩增、缺失、单亲二倍体/杂合性缺失,二个方法联合，可全面捕获MDS克隆证据，提高检出率。,备注：MDS需多指标综合诊断，此种联合也必须建立在骨髓细胞学、骨髓活检、常规染色体分析等方面检测的基础之上。,对61例MDS/CMML患者联合评估,材料和方法韩国8个医院收集经WHO分类的61位MDS/CMML 患者，将地西他滨用于一线治疗方案。,染色体核型分析,IPSS分组,治疗前基因芯片检测,临床跟踪分析,患者信息,基因芯片检出结果联合EZH2、TP53基因突变对OS、EFS的影响。,1 MDS克隆性基因突变套餐（20种）,目的：寻找MDS病态造血
14、的克隆性证据，辅助疾病亚型分类及 预后判断。适用人群：疑似MDS患者指标权威参考：覆盖WHO指南、NCCN指南所提到的基因突变 指标覆盖深度：检出率大于10%TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、U2AF1、TP53、RUNX1 检出率在5-10%EZH2、ZRSR2、STAG2、NRAS 检出率在2-5%BCOR、SETBP1、IDH1、IDH2、ETV6、JAK2、CBL、KRAS,MDS相关基因突变检测,突变位点,无临床意义,有临床意义,多态性,非多态性,胚系突变,获得性突变,胚系与获得性鉴别：,髓系肿瘤中常见的胚系突变（RUNX1、ETV6等）可导致克隆性造血已明
15、确的获得性突变导致MDS的克隆性造血,2 髓系肿瘤高频基因突变（30种）,目的：AML、MDS、MPN/MDS等疾病的高频基因突变检测适用人群：疑似MDS患者、AML患者覆盖广度：MDS检出率大于10%TET2、DNMT3A、ASXL1、SF3B1、SRSF2、U2AF1、TP53、RUNX1 AML检出率在10%IDH1、IDH2、FLT3/ITD、NPM1、KIT、CEBPA、DNMT3A、NRAS、WT1 JMML相关基因：KRAS、NRAS、CBL、PTPN11、NF1、SETBP1 CMML相关基因：TET2、SRSF2、ASXL1 其他 BCOR、BCORL1、STAG2、PIGA、PHF6、JAK2、EZH2、ETV6、ZRSR2,3 送检标本要求,（1）口腔黏膜：采样前30分钟内禁止吃东西、喝水或任何饮料。采样时，用力刮取两侧脸颊内口腔黏膜，左右脸颊 都要刮，每侧10次，共刮取3-4根棉签），棉签在空气中自然晾干2h后，保存于EP管或无菌管中，4保存，72h送检。（2）头发：清洗头发后，2小时内取头发5-6根（要求带有明显的毛囊组织），保存于EP管中，4保存，72h 送检。（3）指甲：指甲清洗干净后，取5-10mm长，1-2mm宽的指甲块，3-4块，常温保存于EP管中送检。,Thanks for your attention!,
