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1、PCR检测技术培训班教材山东省畜牧兽医总站检验技术中心二OO七年六月目 录PCR的概述3蓝耳病病原检测方法16高致病性蓝耳病病原检测方法18口蹄疫RT-PCR检测方法20猪瘟RT-PCR检测方法22禽流感病毒通用RT-PCR检测方法24禽流感病毒H5亚型RT-PCR检测方法26禽流感病毒H7亚型RT-PCR检测方法28禽流感病毒H9亚型RT-PCR检测方法30新城疫病毒RT-PCR检测方法32PCR的概述PCR即聚合合酶链技术最早于1983由美国的Kary Mullis提出，并用于人基因遗传变异研究，成功地扩增了-珠蛋白DNA，实现了胎儿镰刀形红细胞贫血病的产前诊断。这一技术的提出可以说是分子
2、生物学技术的伟大创举，人类从此开始大规模地进行基因研究，并取得丰硕成果，这一技术也由于其所做出的巨大贡献，提出者Kary Mullis荣获人类科学的最高奖项诺贝尔化学奖。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）用于PCR，大大简化了PCR的操作，并明显改变了扩增反应的特异性和扩增效率。随着Taq酶的应用和自动扩增仪的诞生，PCR技术更为简便、快速和自动化，PCR的普及应用也随之迅速加快进程，20多年的时间PCR技术迅速渗透到生物科学工作者的各个领域，成为分子生物学技术实验中最基础的技术之一，也可以说是分子生物学实验技术的基石。一、PCR的分子基础核酸在了解PCR之前，我们先来认识一
3、个PCR所依赖的分子理论基础。大家知道进行PCR时，首先需要得到PCR扩增的模板，这里指的模板就是核酸，核酸是细胞内贮存和传递信息的分子，是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。核苷酸中的糖有核糖和脱氧核糖两种。由核糖构成的核酸称为核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）；由脱氧核糖构成的核酸称为脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）。核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(a
4、denine,A)，嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存在于DNA中。核苷酸中的磷酸基因可含1、2、3个，分别称为一磷酸，二磷酸和三磷酸核苷。要合成核酸，必须是三磷酸核苷。核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5位磷酸与下一位核苷酸的3-OH形成3，5磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖
5、基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5位不再与其它核苷酸相连的5末端，以及核苷酸的戊糖基3位不再连有其它核苷酸的3末端。核酸的合成遵循Watson-Crisk碱基互补配对原则，即严格按照G-C，A-T（U）互补配对，由一条DNA链（模板链）复制出的新链与模板链互补。核酸链的增长按5 3方向进行，每一次增长一个核苷酸，合成DNA以dNTP为底物，合成RNA则以NTP为底物。DNA的合成需要DNA聚合酶的催化才能实现。以DNA为模板合成RNA的过程称为“转录”，相反以RNA为模板合成DNA的过程称为“反转录”，反转录过程需要反转录酶。DNA双螺结构
6、及合成二、PCR定义PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。 三、PCR的发展史PCR的最早设想：核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR的实现：1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的
7、聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导
8、致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会
9、被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR得到广泛应用。 四、PCR的基本原理PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下
10、轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。五、PCR操作流程PCR操作流程主要包括：模板的制备、PC
11、R（RT-PCR）、电泳、紫外检测和结果记录与分析几个部分。模板的制备：目前常用的方法有：(1)有机提取法；(2)Chelex-100提取法；(3)无机提取法等。苯酚/氯仿提取DNA是最经典的有机提取方法。PCR：以DNA为模板则直接进行PCR扩增；以RNA为模板先进行反转录，再进行PCR（即RT-PCR）。凝胶电泳：是检测PCR产物最常用、最简便的方法。通过凝胶电泳检测，我们可以判断PCR反应扩增产物的大小。根据检测的目的基因不同，PCR扩增后可产生不同大小的扩增片断，如大片断的扩增产物其分子量大，在凝胶电泳中的泳动速度就慢，而小片断的扩增产物在电泳中的泳动速度则快，因此，通过凝胶电泳判断扩
12、增片段的大小就可以满足检测的需要。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于检测大于500bp的DNA片段，而后者则主要用于检测小片段的DNA。紫外检测：凝胶电泳检测法，扩增产物显示的方法主要有溴化乙锭(EB)染色和银染法两种。 结果分析：需要对PCR结果进行分析，以确定PCR反应是否达到预期目的，是否扩增失败，没达到预期目的及扩增失败的原因所在？当然更重要的是你所出具的诊断意见以及处理意见。六、PCR的反应特点1、特异性强：PCR以特定靶序列为检测目标，针对性强，所以具体很强的特异性。2、灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10-12级的起始待测模
13、板扩增到微克(mg= 10 -6)水平。理论上可以检出一个病原体单拷贝基因的存在。3、简便、快速：PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。 4、对标本的纯度要求低：几乎所有的临床样品都可以作为PCR的检测材料。对病原微生物只要求样品中有完整的靶序列核酸，不一定有存活的病原体。七、PCR的几个要素1、PCR反应的模板：可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，先经过逆转录生成cDNA然后再进行PCR反应。PCR反应体系中，对模板的要求如下：纯化的模板：DNA模板的来源广泛(可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床组织标本、犯罪现场标本、病理标本和考古标本中提取)，无论来源如何，待扩
14、增的核酸模板都需要经过纯化处理以除去DNA聚合酶抑制剂。模板的形式：含有目标靶序列的模板DNA可以通过单链或双链的形式加入PCR反应体系中。小片段模板DNA：尽管PCR对模板大小的要求不是十分严格，但是通常小片段模板DNA的扩增效率要高于大分子。因此，建议在PCR反应前使用机械剪切或者限制性内切酶消化基因组DNA以提高产量。适宜的模板量：理论上PCR反应的最佳工作条件需要目标靶序列的单一拷贝作为模板，然而实际工作中常常在反应体系中存在数千拷贝的目标DNA。在哺乳动物基因组，通常每次PCR最多取1g的基因组DNA作为模板，而这已含有多达3105常染色体基因的拷贝。而对于简单得多的酵母、细菌及质粒
15、基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。2、引物 (primers)：PCR扩增产物的大小以及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择与序列关系到PCR的特异性。一旦确定引物的序列，就可以用核苷酸合成仪合成引物。由于合成的引物中可能含有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整序列和脱嘌呤产物以及可以检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可以导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR反应所用的引物必须是高质量的引物，且需要纯化。通常可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法、离子交换法、高效液相层析法或寡聚核苷酸纯化柱法纯化。然而，使用自动DNA合成仪合成的寡
16、聚核苷酸引物通常可以直接用于标准 PCR而不需要纯化。引物不使用时应在-20保存。在-20下，冻干引物至少可以保存12-24个月，液体状态则可以保存6个月。引物设计基本原则：一对引物，分别与模板的5 和3端互补；长度：15-30个核苷酸；引物内、引物间不应有互补序列；引物与非特异扩增区无同源性。在PCR反应体系中，引物的浓度一般要求在0.1-0.5M之间，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30次。引物浓度过低，则产物量低；引物浓度过高则会促进引物二聚体的形成以及非特异性产物的形成。非特异性产物和引物二聚体都可以作为PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP
17、底物，从而抑制靶序列的扩增。PCR缓冲液：反应缓冲系统提供PCR反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L的Tris-HCl (pH8.3-8.8，20)，在72(通常PCR反应延长阶段的温度)时，其pH值为7.2左右，故在实际的PCR反应体系中，其pH值变化于6.8-7.8之间。还可以向反应缓冲系统中加入Taq酶保护剂，如小牛血清白蛋白(100g/ml)、明胶(0.01%)、Tween-20(0.05%-0.1%)或二硫基苏糖醇(DTT，5mmol/L)等。另外，现在许多酶产商的反应缓冲系统中还含有适量的KCl（50mM）及所有耐热的DNA聚合酶的活性都需
18、要二价阳离子(通常是Mg2+)。底物dNTP： 四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为PCR反应的合成原料。在标准的PCR反应中各种dNTP的浓度应相等，若任何一种浓度明显不同于其它几种时，会诱发聚合酶的错误掺入从而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响到PCR反应的速度和特异性，因此应严格的控制PCR反应体系中dNTP的浓度，具体要求详见第四节。许多厂商出售专门用于PCR的dNTP储存液。这种储存液具有较强的酸性而不含焦磷酸盐，其目的是保护dNTP在储存液的冷冻和加热期间受到破坏。因此在使用前应用NaOH将pH值调至7.0-7.5。无论是自配的还是购买的dNTPs溶液在储存前都应分成较小的几份
19、，然后在-20下储存，经过两次冷冻-加热循环后储存液就必须丢弃。若长期在-20下冻存，储存液中的少量的水分会蒸发而后凝结在储存容器上，因此储存dNTP液的容器在加热后应在微型离心机中离心数十秒以减少dNTP浓度的变化。耐热DNA聚合酶(thermostable DNA polymerase)：1983年美国PE Cetus公司的Kary Mullis使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段首先建立了PCR技术，其延伸温度为37，然而由于Klenow片段在95的DNA变性温度下完全失活，因此在每轮循环步骤之后都需要再添新酶，操作十分繁琐，并导致反应体系中形成快速沉积变性的酶蛋白。此外，由于K
20、lenow片段聚合反应温度偏低，引物与模板的非特异性结合增加，导致非特异性产物增多；同时，由于受到某些DNA二级结构的影响，聚合反应不完全，得不到完整的PCR扩增产物。直到1987年，发现了热稳定的Taq DNA聚合酶(Taq pol)等耐热的DNA聚合酶后，才使PCR技术有了重大的发展并逐步实现了自动化。耐热DNA聚合酶能经受95以上的高温而不失活，因而无需在每轮循环中添加新酶；同时它催化的聚合反应的最适温度为70-80，此时引物与模板结合的特异性好，故产物的纯度高。现在已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性，但各耐热DNA聚合酶的性能尚有一定的差别。目前在PCR
21、反应中应用最多的是 Taq酶。PCR的反应温度和循环参数：PCR反应是一个重复的循环过程，每一循环包括三个阶段的反应，加热而导致模板的变性，变性后寡聚核苷酸引物和与它互补的单链靶序列杂交而退火以及由热稳定DNA聚合酶的介导使已杂交的引物的延伸。变性温度与时间：在PCR反应中，能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。只有当模板DNA和PCR反应产物完全变性成为单链后，引物才能在退火过程中与模板结合。变性通过加热来实现。变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量。双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长
22、度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR的失败。退火的温度与时间：退火的温度决定着PCR反应的特异性。引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。引物长度越短、G+C的比率越低，所需的退火温度就越低。一般来说，降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度可减少引物与模板间的非特异性结合从而提高反应的特异性，但扩增效率
23、下降。退火温度确定后，退火的时间并不是关键性的因素，但也应加以控制。退火时间过短，会导致延伸失败；而退火时间太长会增加引物与模板间的非特异性结合。 延伸温度与时间：延伸的温度取决于所使用的DNA聚合酶的最适温度，一般延伸的温度设定在所用的DNA聚合酶的最适温度附近以获得最大的扩增效率。不合适的延伸温度不仅影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。延伸的时间视待扩增DNA片段的长度而定。在最适温度下，核苷酸的掺入率为35-100个核苷酸/秒，故延伸1-1.5min对于2kb的扩增片段已经足够，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。循环次数：循环次数决定着扩增的程度。在其它参数都已优化的前提下，循环
24、次数取决于最初靶分子的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量及碱基错配数，此外还会导致PCR反应“平台效应”的出现；循环数太少会影响正常的PCR产物量。八、PCR技术实验室的质量控制1、 设备条件实验室条件：PCR实验室通常分为四个区，现分述如下：样品处理区：主要用于样本的处理，如记录、分类等；DNA提取区：该区主要用于样本的DNA提取；PCR扩增区：该区用于PCR反应的加样和扩增；检测区：该区主要用于检测PCR的扩增产物。设备条件：样品处理区应具有普通离心机、水浴箱、恒温箱、烤箱等基本设备；DNA提取区的设备主要是台式高速离心机、旋窝振荡器、干热器、反转摇床、恒温水浴箱、磁力搅拌器、潜水式凝
25、胶电泳装置、微量移液器；PCR扩增区的主要设备应具有超净工作台、漩涡振荡器、小型台式离心机、20-200l移液器一套，低温冰柜、冰箱、扩增仪等；检测区主要有电泳仪、电泳槽(潜水、垂直)，紫外透射仪、干胶系统、图像分析系统等。2、 人员条件：具备相应理论基础知识和相应操作技能的人员，是开展DNA实验技术的基本条件。实验人员应具备熟练技术操作，正确分析判断试验结果，因此对实验技术人员的要求应当是具备一定的资历，如熟悉生物化学、分子生物学等学科的相关理论和技术，具有一定的实际工作或实验操作经历的专业技术人员。对从事该项技术的人员应定期培训、定期考核。3、 操作标准问题 PCR实验室应有完整的规章制度
26、，包括各类仪器设备的正确使用维护及使用纪录。各类标准实验操作程序。 试验试剂的配置，各类试剂瓶上应标有试剂名称、成份、浓度配制的时间。 设置阴性、阳性对照，以及空白对照。 完整实验纪录，实验纪录应包括实验日期、实验样本、实验操作、实验结果、实验小结。九、PCR常见问题及处理1、 没有扩增产物 循环温度特别是解链温度是否正确，对于富含G+C的目的基因97的温度可以使解链更加有效，但过高的温度会影响酶的活性，有效的解决方法是在加Taq聚合酶前先使模板在97-95变性5-10min。有的PCR仪由于长期使用，其所显示的温度与实际温度不一致，应定期对仪器进行维护及测试。 引物的组成是否正确，有无二级结
27、构的形成。 聚合酶的活性是否正常。 反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物的降解。将模板置95以上处理，可以抑制蛋白酶和核酸酶的活性。 某一些样本，蛋白质成份除去不完全，这样可以抑制PCR反应，再用蛋白酶K重新处理样本，可提高扩增效率。2、有非特异性产物形成或产物在电泳凝胶中呈涂布状提高退火温度，缩短退火及延伸时间:选择合适的退火温度可以提高PCR反应的效率，大大减少引物与模板的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。引物的退火温度与时间取决于引物的碱基组成(G+C的含量)、长度和浓度。 调整引物、TaqDNA聚合酶或模板用量:PCR反应中引物的终浓度一般为0.1-1mol/L，
28、如果引物浓度低于0.1mol/L时，PCR产物产量降低。引物浓度过高会促进引物的错误引导合成非特异产物，增加引物二聚体的形成，如果引物二聚体出现在早期的循环中，可成为PCR反应的模板，与靶序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。TaqDNA聚合酶在70-75时具有最高的生物学活性，75-80条件下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸。温度降低时，TaqDNA聚合酶延伸速度明显下降。 调整Mg2+用量:Mg2+影响着TaqDNA聚合酶的活性，同时还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低，过高时，
29、则酶催化非特异性扩增。 减少循环次数:循环次数决定着扩增程度，过多的循环会增加非特异扩增产物，过少的循环次数，PCR产物量就会极低。3、 引物二聚体的形成 检查引物的序列，特别在3端是否有互补区。 提高退火温度。 调整引物与模板浓度，使模板比例增高。 增加引物长度。 减少循环次数。4、PCR技术中污染问题污染原因：样品间交叉污染：样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢出容器外，或容器外粘有其他样品而造成相互间交叉污染；样品DNA在提取过程，由于微量移液器(加样枪)污染导致样品间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。PCR试剂的污
30、染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于吸样枪、容器、双蒸水及其它溶液被其它样品污染。PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要、最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性；还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考
31、虑有无污染或是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。设立阳性对照：在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。设立阴性对照：每次PCR试验务必做阴性对照，它包括标本对照：被检标本是血清就用鉴定后的正常血
32、清做对照；被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照；试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。重复性试验:对可疑结果进行重复试验防止污染的方法合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应试剂、循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开，最好能划分标本处理区；PCR反应液制备区；PCR循环扩增区；PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，试验前应将试验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。在DNA模板和多聚酶加入前，紫外线照射反应管内容物，一般选用波长254nm照射30min。微量移液
33、器:是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸是要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。预混和分装PCR试剂:使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20保存，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外，PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。防止操作人员污染:使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。设立适当的阳性对照和阴性对照:阳性对照以
34、能出现扩增带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反映都应由一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。减少PCR循环次数，PCR产物达到检测水平就适可而止选择质量好的Eppendorf管:以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG):也称为尿嘧啶-N-糖基化酶(UraciI N-glycosylase,UNG)可移除DNA中的尿嘧啶，在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所
35、以在PCR扩增前对新配制的反应物用UDG处理以降解交叉污染的PCR产物，而不降解要扩增的基因组DNA模板，然后热灭活此酶，再进行扩增反应。十、PCR的种类随着科学技术的发展，PCR的种类越来越多，不胜枚举，由于篇幅所限这里不一一列举。十一、PCR的应用领域1、生物学领域：几乎无处不用，基因、DNA片段的克隆；人工基因构建；DNA序列测定；基因定点突变；基因型（突变）检测；SNP分析，遗传背景分析；生物物种鉴定，系统进化研究；基因表达量研究（real-time PCR）/ 基因表达谱研究（ DNA chip）2、医学领域：疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断；致病病原体的检测；肿瘤治疗中癌基因的检
36、测；会推广到大部分疾病治疗前的检测；DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证；其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测） 3、兽医方面：四大动物疫病（ND、FMD、HPAV、CSF）；除此之外的大多数动物病毒性疫病；部分动物细菌性疫病。十二、结语PCR经过20多年的发展，已成为当今分子生物学领域举足轻重的实验室及实际应用技术，近年来发明的荧光定量PCR使得PCR更为简便、快速，将来会进展成什么样很难说，但有一点可以肯定，PCR技术永远是分子生物学研究的最重要技术手段之一。同时，PCR技术在兽医领域的应该也将越来越广泛，会成为我们日常检测的主要技术。蓝耳病病原检测方法 1.概况猪繁殖与呼吸综合
37、征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种传染病，妊娠母猪主要表现为流产、死胎、木乃伊胎，仔猪以呼吸系统疾病为特征。该病分布广泛，给养猪业造成了严重的经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为B类动物疾病，上世纪90年代该病传入我国，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国列为二类动物疫病。2.蓝耳病病原学检测方法原理：利用异硫氰酸胍方法提取RNA，在反转录酶的作用下，以R
38、NA为模板，以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异性DNA片段的基因拷贝数放大一倍。经过35个循环，最终使基因放大数百万倍。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见DNA片段的扩增带。该方法可以检测到普通蓝耳病病毒以及变异株蓝耳病病毒，检测到阳性后可以采用变异株蓝耳病病毒RT-PCR方法进一步检测是否是变异株。试剂RNA提取试剂：变性液、醋酸钠溶液、酚/氯仿/异戊醇混合液、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理的灭菌去离子水、RNA酶抑制剂，阳性对照。RT-PCR反应试剂：反转录酶、RNA酶抑制剂
39、、RT-PCR反应液、TaqDNA聚合酶、矿物油。电泳试剂：50倍TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、上样缓冲液、灭菌去离子水 器材仪器：分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像系统、液氮或-70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20冰箱、可调移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20ml一次性注射器、1.5ml经焦炭酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、吸头（10ul、200ul、1000ul）、电泳级琼脂糖、量筒、锥形瓶、灭菌双蒸水。 样品样品采集：取猪肺、扁桃体、脑等组织及血清，4或低温保存，送实验室检
40、测。病料采集要新鲜，最好采集病变与健康临界部位。样品处理：每份样品分别处理。组织样品的处理：称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mlPBS（PH7.2）继续研磨，取已经研磨好的待检组织液，置1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心5min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混匀。血清样品的处理：取血清100ul，置1.5ml灭菌离心管中，加入300ul消化液，混匀。阴阳性对照处理：取阴性/阳性对照100ul，置1.5ml灭菌离心管中，加入300ul消化液，混匀。RNA提取：处理好的样品，每管依次加入醋酸钠溶液30ul，酚/氯仿/异戊醇混合液300ul，颠倒10次，混匀
41、，冰浴15min，412000rpm离心15min。取300ul上清于经DEPC水处理的新的1.5ml离心管中，加入300ul异丙醇，混匀，置液氮3min或-7030min，室温融化，415000rpm离心20min。弃去上清，沿管壁缓缓加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣在吸水纸上1min，真空抽干至无乙醇味道。加入9ulDEPC处理的灭菌去离子水和1ulRNA酶抑制剂，混匀溶解。RT-PCR取21.5ulRT-PCR混合液、0.3ulRNA酶抑制剂、0.2ul反转录酶、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的样品RNA于PCR管中，在PCR仪中进行如下循环
42、：4245min，943min；9430sec，5530sec，7230sec，35个循环后，72延伸7min。电泳观察结果：称取2g琼脂糖于100ml1倍稀释的电泳缓冲液中，于微波炉中熔解，加入10ul溴化乙锭混匀。在电泳槽中放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，凝固后将梳子取出，将扩增产物10ul混合1ul上样缓冲液，点样于上样孔中，以80-120V电压进行电泳，30min后在紫外凝胶成像系统观察结果。阳性对照出现660bp扩增带，阴性对照无对照扩增带（引物带除外）时，实验成立，试验样品出现660bp扩增带为PRRSV阳性，否则为阴性。 高致病性蓝耳病病原检测方法 1.概况高致病性蓝耳病(PRRS)是
43、由蓝耳病变异株引起的的一种急性的传染病，2006年6月开始在江苏、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、河南等地发生并流行，截至到2007年6月，我国已经有22个省市发生高致病性蓝耳病。主要引起猪的发烧、厌食或不食、眼结膜炎、咳嗽、喘等呼吸道症状，后驱无力、不能站立或摇摆等神经症状。变异株蓝耳病传染性强，流行期长，在一个地区内迁延数月无明显好转，常规治疗无明显疗效。发病猪部分年龄段均出现急性死亡。变异株蓝耳病病毒与国外其他分离株相比，在NSP2的481和532560位氨基酸缺失（共缺失30个氨基酸）。2.变异株蓝耳病病原学检测方法原理：利用异硫氰酸胍方法提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，
44、以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、中温延伸的循环，使特异性DNA片段的基因拷贝数放大一倍。经过35个循环，最终使基因放大数百万倍。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见DNA片段的扩增带。该方法在蓝耳病NSP2变异区设计引物，对高致病性蓝耳病进行检测，对普通株蓝耳病不能进行检测，与通用蓝耳病RT-PCR试剂盒配合使用。试剂RNA提取试剂：变性液、醋酸钠溶液、酚/氯仿/异戊醇混合液、异丙醇、75%乙醇、DEPC处理的灭菌去离子水、RNA酶抑制剂，阳性对照。RT-PCR反应试剂：反转录酶、反转录反应液、RNA酶
45、抑制剂、PCR反应液、TaqDNA聚合酶、矿物油。电泳试剂：50倍TAE电泳缓冲液、溴化乙锭、上样缓冲液、灭菌去离子水 器材仪器：分析天平、台式冷冻高速离心机、真空干燥器、制冰机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像系统、液氮或-70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20冰箱、可调移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20ml一次性注射器、1.5ml经焦炭酸二乙酯（DEPC）水处理的灭菌离心管、吸头（10ul、200ul、1000ul）、电泳级琼脂糖、量筒、锥形瓶、灭菌双蒸水。 样品样品采集：取猪肺、扁桃体、脑等组织及血清，4或低温保存，送实验室检
46、测。病料采集要新鲜，最好采集病变与健康临界部位。样品处理：每份样品分别处理。组织样品的处理：称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mlPBS（PH7.2）继续研磨，取已经研磨好的待检组织液，置1.5ml灭菌离心管中，8000rpm离心5min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混匀。血清样品的处理：取血清100ul，置1.5ml灭菌离心管中，加入300ul消化液，混匀。阴阳性对照处理：取阴性/阳性对照100ul，置1.5ml灭菌离心管中，加入300ul消化液，混匀。RNA提取：处理好的样品，每管依次加入醋酸钠溶液30ul，酚/氯仿/异戊醇混合液300ul，颠倒10次，混匀
47、，冰浴15min，412000rpm离心15min。取300ul上清于经DEPC水处理的新的1.5ml离心管中，加入300ul异丙醇，混匀，置液氮3min或-7030min，室温融化，415000rpm离心20min。弃去上清，沿管壁缓缓加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣在吸水纸上1min，真空抽干至无乙醇味道。加入9ulDEPC处理的灭菌去离子水和1ulRNA酶抑制剂，混匀溶解。RT-PCRRT（反转录）：取16ul反转录反应液、1ulRNA酶抑制剂、1ul反转录酶、2ul提取的病毒RNA，混匀后，作好标记，在PCR仪上进行以下循环：4260min、985min。PCR（聚合酶链反应）：取16ulPCR反应液、2ulTaqDNA聚合酶、2ul反转录产物，混匀，作好标记，在PCR仪上进行以下循环：9430sec、5530sec、72sec、35个循环后，72延伸5min。电泳观察结果：称取2g琼脂糖于100ml1倍稀释的电泳缓冲液中，于微波炉中熔解，加入10ul溴化乙锭混匀。在电泳槽中放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，凝固后将梳子取出，将扩增产物10ul混合1ul上样缓冲液，点样于上样孔中，以80-120V电压进行电泳，30min后在
