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1、单细胞成像观测研究简介*袁倬斌（中国科学院研究生院化学与化学工程学院，中国科学院研究生院应用化学研究所，北京100049）（一）前言单细胞成像（图像）分析已采用荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、多光子荧光显微镜、全内射荧光显微镜、荧光寿命图像显微镜、近场扫描光学显微镜、荧光相关光谱显微镜、生物发光及化学发光显微镜、激光热透显微镜、质谱（动态二级离子质谱、TOS-SIMS、MALDI-MS）、电子显微镜（扫描电镜及透射电镜）、共聚焦拉曼显微镜、同步加速器X-射线显微镜、扫描电化学显微镜、原子力显微镜、扫描坠道显微镜等。在此，主要介绍单细胞的原子力显微镜成像（图像）观测研究，其它方法则只作简介。1.1
2、 单细胞分析的目的和任务（1）细胞：细胞（cell）是生物体的形态结构和生命活动的基本单位，是独立生存的生命实体，是展现活的生命状态全部特点的最小单位，是组成（构成）所有生命物质的基本单元。细胞是生命的缩影，它不仅体现了生命的多样性和统一性，更体现了生命的复杂性。它是以膜为界的一个小室，充满着生物分子，其浓度和组成的变化都决定着细胞的生存、繁殖、损伤和死亡。细胞的新陈代谢、呼吸作用、光合作用都与细胞的整体状况有关。大多数的生物化学反应也都是在细胞中进行的。恩格斯早就指出：人们在整个有机界里所看到的最简单的类型是细胞；它确实是最高级的组织基础。为此，要了解生物体的生命活动的规律，就必须从它的基础
3、，细胞研究入手。细胞学（cytology）就是研究细胞的结构、功能和生活史的科学。研究的对像就是细胞。（2）干细胞：干细胞（stem cells）是一类具有自我更新和分化潜能的特殊细胞。目前人类胚胎干细胞（embryonic stem cells）已可成功地在体外培养，变成所需要的功能细胞，以替换坏死的细胞，从而修复病变的组织以治疗疾病。这种被誉为“源泉细胞”或“万能细胞”的干细胞可以分为三类：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。_* 本工作承：国家自然科学基金（20175025. 29875027）；国家自然科学基金分析化学重点基金（20235010）；电分析化学国家重点实验室基金；国家中药
4、“95攀登计划”（国中医科（1998）19号）（中医研究院中药研究所，中国科学院研究生院应用化学研究所，中国同仁堂集团公司）；国家科技部“95”国家重点科技攻关项目（96-A23-06）及“十五”国家重大科技攻关项目（2001BA210A04-7）和中国科学院的资助，特在此致谢。全能干细胞可以分化成人体的各种细胞。人类的精子与卵子最初结合形成受精卵，这个受精卵就是一个最初始的全能干细胞，之后，一个分裂成两个完全相同的细胞，两个分裂成四个，八个。八个中的任何一个细胞单独放入女性子宫中均可发育成个体。这些细胞也称胚胎干细胞。全能干细胞在进一步的分化中，形成各种多能干细胞。多能干细胞具有分化为多种细
5、胞组织的潜能，但却失去发育成完整个体的能力，如神经干细胞。多能干细胞进一步分化，又形成专能干细胞，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如肌细胞。从理论上来讲，干细胞是各类疾病的克星。通过干细胞技术，可以把一种组织的干细胞直接移植给相应组织坏损的病人。而且，如果掌握了干细胞向某种组织细胞分化的条件，就可以在体外对干细胞进行诱导使之“定向”分化成所需的细胞，把这些分化的细胞进行筛选，把“合格”的细胞移植给病人，代替病人已坏死的细胞。（3）细胞生物学（现代细胞学）：生物学是研究生物的结构、功能、生活史、生命现象与活动规律的科学，所以细胞生物学（cell biology）就是研究细
6、胞的结构、功能、生活史以及各种生活活动本质和规律的科学，是生物科学的主要分支之一，也是生命科学和分子生物学研究的基础。当前细胞生物学已进入分子生物学的水平，而且从广泛的范围来说，细胞生物学应属于现代生物学教育的中心。细胞生物学既然是生命科学研究的基础，因此，生物科学上的许多基本问题，必须在细胞中谋求解决。它的研究目的，不仅在于阐明各种生命活动的现象与本质，而且还必须进一步对这些现象和发展规律加以控制和利用，以达到为生产实践服务的目的，造福于人类。为什么要用细胞生物学，而不用现代细胞学呢？因为，现代细胞学，在形态方面，已经超出了光学显微镜下可见结构的简单描述范围；在功能方面，也已经超越了对于生理
7、变化的纯粹描述时期。近30多年来随着分子生物学的发展，新方法、新技术不断涌现，细胞研究已从细胞整体和亚细胞结构水平深入到分子水平。目前，已把细胞的整体活动水平、亚细胞水平和分子水平三方面的研究有机地结合起来，以动态的观点来考察细胞和细胞器的结构和功能，探索细胞的基本生命活动，如生长、发育、分化、代谢、免疫、繁殖、运动和联络、衰老与死亡、遗传变异和进化等基本规律。它不仅仅孤立地研究一个个细胞器、生物大分子和小分子，以及生命活动现象，而是研究它们的变化发展过程，研究它们之间的相互关系以及它们与环境之间的相互关系。它的研究范围大大地超过了过去的细胞学。因此，现代细胞学改用新的名称，即细胞生物学。生物
8、的生殖、发育、遗传、神经（脑）活动等重大生命现象的研究都要以细胞为基础。植物与动物生长发育是依靠细胞增殖、细胞分化与细胞凋亡来实现的。人大脑的活动是靠1012个细胞及其相互协调而进行的。一切疾病的发病机制也要以细胞病变研究为基础。以基因工程为主的现代生物技术主要是通过对细胞操作为基础而进行的。因此，细胞生物学与农业、医学、生物高技术发展有着密不可分的关系，它将在解决人类面临的重大问题，促进经济和社会发展中发挥重要的基础作用。总之，细胞生物学是应用现代物理学与化学的技术成就和分子生物学的概念与方法，以细胞作为生命活动的基本单位的思想为出发点，探索生命活动规律的学科，其核心问题是将遗传与发育在细胞
9、水平上结合起来。还应指出，细胞生物学是一门正在迅速发展中的新兴学科，与其他生物学科相比较，还不具备完整的学科体系，其研究内容与范畴往往与生命科学的其他学科交错在一起，甚至目前很难为细胞生物学划出一个明确的范围。综上看出，细胞的研究已从细胞的整体和亚细胞结构水平深入到分子水平的过程，即进入到生物化学、现代化学和现代物理与生物科学的交叉领域研究。（4）现代分析化学北京大学徐光宪院士说，“一门学科的定位是与时俱进的”。恩格斯把19世纪的化学定位为原子的科学，因为化学变化是原子的几何位置移动，而原子本身不变的变化。20世纪的化学被定位为分子的科学，21世纪的化学可以定位为“创造和识别泛分子的科学”。化
10、学是研究泛分子（Pan Molecules）的科学，是创造和识别泛分子，发现化学规律及其应用的一门自然科学。现代分析化学（Contemporary Analytical Chemistry）是人们获得分析组成、结构和信息的科学，是识别泛分子的科学，是化学测量与表征的科学。要进行有效的测量、表征及识别泛分子，并获取灵敏、可靠与有用的信息，就必须采用、改进和研制先进的、尖端的科学仪器（分析仪器）。现代分析仪器，是大脑、眼和手的延伸，是人类智慧的结晶，可以说没有先进的、尖端的分析仪器，就没有现代分析化学。其实20世纪最伟大的科学工程之一，报刊上广为宣传的“人类基因计划”，实质上是“人类基因的化学测序
11、计划”。这是1985年美国首先提出的一项希望解开人类生老病死的奥秘，并彻底破解控制各种疾病基因密码的国际科学研究工程，是人类生命科学史上最伟大的工程。1990年美国启动了“人类基因组计划”（Human Genome Project）的浩大工程，计划利用15年的时间完成人类单倍体数染色体所含全部基因的测序工作。1999年11月“Nature”报道，经几国学者的共同努力，已完成了人类第22对染色体DNA的测序工作，这是“人类基因组计划”的重大研究进展。继美国之后，欧共体、意大利、日本、俄罗斯、法国、加拿大、澳大利亚和中国亦先后开展了人类基因组的基因克隆和测序研究。2000年6月26日，美国、日本、
12、英国、法国、德国和中国6国科学家同时宣布，人类基因组“工作框架图”绘制完成。至此，“人类基因组计划”测序任务提前完成，这是一大批各国科学家共同合作，历时10年辛勤劳动的辉煌研究成果。这一天是人类自然科学史上值得纪念的日子。这项计划的完成必将大大造福于人类。这一计划虽是生物学家提出来的，却是分析化学家完成的。但分析化学家非常谦虚，很少在报刊上宣传。（5）单细胞分析的目的单细胞分析的目的是了解生物体生命活动的规律，必须以研究细胞为基础，考察细胞的结构和功能，探索细胞的生命活动，如细胞的生长发育、代谢与繁殖、运动与联络、衰老与死亡、遗传与进化等。掌握和控制生、老、病、死的规律，造福于人类。单个细胞有
13、望用于癌症早期诊断。分析速度及费用的障碍已经消除，单细胞分析用于疾病诊断已经展现出光辉前景。（6）单细胞整体分析单细胞整体分析是指分离和测定单细胞的化学组分，这是单细胞分析中最基本也是相对来说最简单的任务。但与其它分析对象相比较，仍是十分复杂独特的任务。细胞的化学组分主要由水、蛋白质、脂类、糖类及无机物组成（表1.6）。表1.6 细胞的化学组分物 质含量（%）种 类水85-90游离态及结合态水蛋白质7-10清蛋白、球蛋白、组蛋白、鱼精蛋白、核蛋白脂类1-2脂肪、磷脂糖类1-1.5单糖、多糖、粘多糖、糖蛋白、糖脂无机物1-1.5Na+、K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，SO4，POC43+单个细
14、胞中的组分分析，是在细胞水平上了解生化反应的基本要求，一般，细胞的体积小（直径7-30），组分复杂（除无机物外还有核酸、蛋白质、酶、脂质和碳水化合物等），而且组分的含量极微（10151021mol/L），则对分析技术提出具有高选择、高灵敏、快响应和超小体积的要求。从上看出：现代分析化学已由：常量微量（ppm；106g；微克）痕量（ppb；ng;109g；纳克）超痕量（ppt；1012g；皮克）飞克（5g；1015g）阿克（ag；1018g）则克（Zg；1021g），甚至哟克（Yg；1024g）（7）单细胞的表面分析（8）单细胞的生活环境（原位，离位，其它条件）等条件存在情况下的分析，如：实时动
15、态监测单细胞胞吐释放及胞内分子反应等。1,2 单细胞成像（图像）表达的情况简介（1）光学量微镜（远场光学量微镜）观察的结果（如图1） 图1（2）电子显微镜观察的结果（如图2） 图2（二）原子力显微镜用于单细胞分析 9.1 前言原子力显微镜（atomic force microscope, AFM）是以探针针尖与待测物原子之间的范德华力作用为基础发展起来的一种现代成像分析仪器，目前在扫描探针显微镜（scanning probe microscope, SPM）家族中灵敏度最高、分辨率最好并且应用范围也最广，它对待测物要求低，既可以是导体也可以是非导体，且实验可在真空、气体甚至在液体的环境中也能正
16、常进行。显微镜在生物实验科学的发展中一直起着非常重要的作用。一个正常人眼睛的分辨率大约为0.2mm，不能直接观察到比0.1mm更小的物体或物质的结构细节。早在17世纪，人类就通过玻璃透镜观察到水中的微生物；到了19世纪，光学显微镜的出现，延伸了人的视力，可以看到微生物、细菌（1m）和细胞(直径一般为5-500m，体积为fL-nL级)那样小的物体，光学显微镜的应用推进了医学和生物学的大发展，但由于光波的衍射效应，使得光学显微镜的分辨极限只能达到可见光（400-700nm）波长的一半，故光学显微镜的最高分辨率为200nm，这个分辨率对于研究细胞内完整的细微结构是远远不够的。要想在单原子和单分子层次
17、观察微观世界，就必须改用比光子波长短几个数量级的电子束作光源，才可以获得更高的分辨率。1931年，M. Knoll和E. Ruska研制出第一台透射式电子显微镜（TEM），开创了人类观察分析物质世界的新纪元。1933年E. Ruska教授等研制成功商品仪器，经过不断的改进，到80年代初，TEM对点的分辨率达到0.2nm，实现了在原子尺度上观察物质结构的理想；1935年，M. Knoll制成第一台扫描电子显微镜(SEM)，经多人改进，直到1965年，第一批商品仪器在英国出台。1971年研制成功第一台扫描透射电子显微镜(STEM)，并用它观察到了单个铀原子图像；但电子显微镜必须在真空的条件下进行观
18、察。对生物大分子还须进行梯度脱水、染色、临界点干燥、喷涂导体物质等前处理工作，故只有在接近天然条件和生理条件下研究生物样品的扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope, STM）、AFM、扫描电化学显微镜（SECM）和扫描探针显微镜（SPM）提出17后，生物样品的单原子、单分子和单细胞的成像才得以实现。 9.2 扫描隧道显微镜（STM）1982年，Binnig和Rohrer等1研制成功了第一台STM。STM的出现，是人类第一次能够实时地（real time）观察单个原子在物质表面的排列状态和与表面电子行为有关的物理、化学性质，在表面科学、材料科学和生命科学等领域
19、的研究中有重大的意义和广阔的应用前景，被国际科学界公认为八十年代世界十大科技成就之一。为此，这两位科学家和电子显微镜的发明者E. Ruska教授三人于1986年荣获了诺贝尔物理学奖。与光学显微镜和电子显微镜不同，STM不采用任何光学或电子透镜来成像，而是利用光镜的原子半径级探头的探针在表面上方扫描来检测样品的一些性质110。与其它显微分析仪相比，STM具有下列特点5：（1） 在原子分辨率方面，横向分辨率可达0.10.2nm，深度分辨率高达0.01nm。（2） 能够实时获得表面三维图像。用于周期性或非周期性的表面结构研究。（3） 能够观测最表面层的局部结构信息，而不是体相的平均信息。（4） 可在
20、大气、真空、常温、低温甚至液体中工作。（5） 对样品无高能电子束损伤。（6） 配合扫描隧道谱（scanning tunneling spectroscopy, STS）可获得有关表面电子结构信息。STM的原理非常简单，即在导电性试样和尖锐的金属探针之间加上电压，当探针和试样表面之间的距离接近至1nm左右时，在探针和试样表面之间有隧道电流流过。这一隧道电流和探针至试样表面的距离之间有指数函数关系。若在测量隧道电流的同时使探针在试样表面扫描，则可测得有关试样表面凹凸的信息。若用在三个轴向伸缩的压电元件，使探针扫描，则可以原子级的精度控制探针相对于试样表面的位置，以原子级的分辨率研究试样表面16。S
21、TM不仅能直接观察到物质表面的原子结构，而且能对单个原子进行操纵，导致人们可以用一个一个的原子来构造分子，或者把分子分成一个一个的原子，从而将人类的主观意愿施加于自然，可以说STM是人类眼和手的延伸，是人类智慧的结晶。STM的出现，给纳米科学和技术的发展注入了新的动力，大大地促进了纳米科学的发展。IBM的科学家在1989年利用STM移动氙原子，把一个个原子排列成IBM商标；白春礼等用多个原子组成了一幅中华人民共和国地图；朱清时等用STM成功地研究了C60的成键状况，指出了C60中的双键、单键等等。但是，STM具有以下的局限性：（1） 能观察导体和半导体的表面结构、原子微观世界的三维图，能测隧道
22、电流的分辨率（横向0.1nm，纵向0.01nm），不能直接观察和研究有较厚氧化层存在的样品表面，不能研究非导体和绝缘体表面。（2） 非导电材料，必须在表面覆盖一层导电膜，导电膜的存在，掩盖了表面结构的细节，使STM失去了在原子尺度上研究表面结构的这一优势。（3） 即使对于导体的样品，STM观察的是对应于表面费米能级处的态密度。因此，当表面存在非单一电子态时，STM所得到的是：表面形貌和表面电子性质的综合结果。为了弥补STM的不足，人们把注意力从测量隧道电流转到了测量作用于探针和试样之间的原子间力，获得表面的信息，1986年，原子力显微镜（AFM）诞生了。如果不用隧道电流，而是测量作用于探针和试
23、样表面之间的原子间力，获得表面的信息，则是AFM。 9.3原子力显微镜（AFM） 9.3.1 原理AFM是通过测量作用于探针和试样之间的原子间力，从而获得表面的信息图像的一种新型的现代分析工具。其原理如图1所示：图9.1 AFM示意图AFM的原理较为简单，它是用微小探针“摸索”样品表面来获得信息。如图9.1所示，当针尖接近样品时，针尖受到力的作用使悬臂发生偏转或振幅改变。悬臂的这种变化经检测系统检测后转变成电信号传递给反馈系统和成像系统，记录扫描过程中一系列探针变化就可以获得样品表面信息图像。其结构主要包括检测系统、扫描系统和反馈系统。探针是AFM的核心部件，由金属针尖（Au、Pt）和硅的氧化
24、物或硅的氮化物等组成，尖端的曲率半径在520nm之间11、。目前，微电子工艺刻出的针尖的尖端的曲率半径在20nm以下，如果再经过电子束的加工，则可制得尖端曲率半径仅为几个nm的探针，使分辨率上了一个台阶。一方面发展制造更尖的探针，目前用电子沉积法制造的探针，针尖的曲率半径可在510nm间，准确度有所改变11，也可对标准探针进行生物或化学修饰1112来提高图像的质量等功能，图9.2为接触式V型旋臂常见的一种类型，图9.3为针尖的电镜图9.2 V型旋臂的电镜图图9.3 AFM针尖的电镜图图片。在基本AFM操作系统基础上，通过改变探针、成像模式或针尖与样品间的作用力就可以测量样品的多种性质，其相关的
25、显微镜技术包括有：侧向力显微镜（lateral force microscopy, LFM）、磁力显微镜（magnetic force microscopy, MFM）、静电力显微镜（electrostatic force microscopy, EFM）、化学力显微镜 (chemical force microscopy, CFM) 、力调制显微镜 (force modulation microscopy, FMM)、相检测显微镜 (phase detection microscopy, PHD)、纳米压痕技术（nanoindentation）、纳米刻蚀技术(nanolithography)
26、。 9.3.2 成像模式1. 接触成像模式（contact mode）图9.5 接触成像模式示意图图9.4 原子间的范德华力与距离的关系曲线在接触式AFM中，探针与样品表面利用原子斥力进行“接触”，探针与试片的距离约数个埃（）。当探针逐渐靠近样品表面时，探针表面原子与样品表面原子首先相互吸引，一直到原子间电子云开始相互静电排斥如图9.4所示，这种静电排斥随探针与样品表面原子的进一步靠近，逐渐抵消原子间的吸引力当原子间距离小于1nm，约为化学键长时，范德华力为零当合力为正值(排斥)时，原子相互接触由于在接触区域范德华力曲线斜率很高，范德华斥力几乎抵消了使探针进一步靠近样品表面原子的推力当探针弹性
27、系数很小时，悬臂发生弯曲（图9.5）通过检测这种弯曲就可以进行样品形貌观察13 2. 非接触成像模式（non-contact model）图9.6 非接触成像模式示意图 非接触式AFM不破坏样品表面，适用于较软的样品非接触式AFM中（图9.6），探针以特定的频率在样品表面附近振动利用原子吸引力的变化来产生表面轮廓，探针和样品表面距离在几纳米到数十纳米之间这一距离范围在范德华力曲线上位于非接触区域在非接触区域，探针和样品表面所受的总力很小，通常在10-12N左右在非接触式AFM中，探针以接近于其自身共振频率的频率(一般为1001kHz到400kHz)及几纳米到数十纳米的振幅振动当探针接近样品表面
28、时，探针共振频率或振幅发生变化检测器检测到这种变化后，把信号传递给反馈系统，然后反馈控制回路通过移动扫描器来保持探针共振频率或振幅恒定，进而使探针与样品表面平均距离恒定计算机通过记录扫描器的移动获得样品表面形貌图。3. 敲击成像模式 (tapping mode)图9.7 敲击成像模式示意图敲击式AFM（图9.7）与非接触式AFM比较相似，但它比非接触式AFM有更近的样品与针尖距离和非接触式AFM一样，在敲击模式中，一种恒定的驱动力使探针悬臂以一定的频率振动(一般为几百千赫)振动的振幅可以通过检测系统检测当针尖刚接触到样品时，悬臂振幅会减少到某一数值在扫描样品的过程中，反馈回路维持悬臂振幅在这一
29、数值恒定当针尖扫描到样品突出区域时，悬臂共振受到阻碍变大，振幅随之减小相反，当针尖通过样品凹陷区域时，悬臂振动受到的阻力减小，振幅随之增加悬臂振幅的变化经检测器检测并输入控制器后，反馈回路调节针尖和样品的距离，使悬臂振幅保持恒定反馈调节是靠改变Z方向上压电陶瓷管电压完成的当针尖扫描样品时，通过记录压电陶瓷管的移动就得到样品表面形貌图4. 升降成像模式 (lift mode)图9.8 升降成像模式示意图与非接触式一样，升降成像模式检测共振频率和振幅的变化来获得样品信息AFM家族中的一些技术需要除去形貌特征而得到特殊信息在磁力显微镜和静电力显微镜中，首先获得高度信息，然后把探针抬到设定的高度(一般
30、为10100nm)，再沿形貌图路线扫描样品，从而得到除去高度影响的静电力和磁力分布图9.8为升降成像模式的扫描路线图以这种方式成像时，针尖和样品的距离不受形貌的影响，所得到的图像反映针尖与样品长程作用力的变化，如磁力分布等 9.4 原子力显微镜用于单细胞成像AFM是在STM的基础上发展起来的，它又被称为继光学显微镜、电子显微镜后的第三代显微镜。STM只能用于导电的物质而AFM克服了这一不足，不受样品的导电性的限制，更适合于生物样品的测定因此在生物领域得到了广泛的应用，特别是在单细胞成像上作出前所未有的贡献。 AFM已达原子级和分子级的分辨能力，能在天然条件或生理条件下工作，是当今最适合单细胞成
31、像的观测研究的技术和方法。从1990年起S.A.C.Gould利用AFM对血红细胞和细菌进行了成像观测研究开始，许多科学家都用AFM对活神经胶质细胞中肌动蛋白动态过程14原生态的神经元细胞和神经元细胞受谷氟酸作用的影响15, 16。受伤细胞膜表面的精细结构17。活体神经胶质细胞中肌动蛋白丝的动态过程18进行了成像和观测研究。从文献9可知：AFM也被广泛地用于DNA的分析，近来也有用新方法测定DNA序列及研究DNA不匹配现象的报道；用AFM实时观察水溶液中单个DNA质粒分子由于外来物质引发的超盘旋变化过程，为实时地用于研究生物分子的结构与功能提供了依据；AFM用于蛋白质成像的研究也有报道，Dor
32、n等人合成带有金属络合首基的丁二炔类脂物，用其在表面形成单分子层来固定、定位组氨酸标记的蛋白质/DNA，从而有利于AFM的成像；AFM还可用于研究单分子力谱，如聚丙烯酸的单分子力谱的研究。图9.9 正常鼠脑神经细胞AFM成像图9.10 神经细胞AFM成像单个正常神经细胞尚未生长出明显的突触形状，突触顶端的活性基团之间形成了紧密的连接。袁倬斌研究组19用AFM研究了小鼠服中药后神经元细胞的变化，可非常形象地表征出细胞形貌的变化情况20。本实验室在1988年就作了辣根过氧化物酶(HRP)分子和血清蛋白分子的AFM图形、蛇毒蛋白与金属离子作用后的AFM图形以及乳鼠脑神经元细胞等的AFM图形(见图l4
33、)，为有关项目的研究提供了有力证据。在九五国家攀登计划项目中药现代化关键问题的基础课题“安宫牛黄丸药效与安全性研究”（中国中医研究院中药研究所、中国科学院研究生院应用化学研究所、北京同仁堂集团公司）的研究过程中进行了不同的汞(Hg)化合物形态与脑神经细胞作用机理的AFM和摩擦力显微镜(LFM)研究时，发现有毒物质将使细胞变长变细脱开变小一出现黑点，而服用安宫牛黄丸后，脑神经细胞明显变胖变圆，AFM用于细胞学的细微结构的成像观测，寻找药物作用靶点，探究病理毒理机制，与电镜（EM）结合可进一步研究细胞微观形貌，若对针尖进行电化学和碳纳米管21修饰，可推广AFM在细胞学以及相关学科中的应用。 安宫牛
34、黄丸中汞的含量为4.79，砷的含量为3.89，临床实验已经证实，其中的汞、砷原料药朱砂和雄黄是不可缺少的。利用安宫牛黄丸治疗高烧昏迷病人时，应考虑那些能够通过血脑屏障的不同形态的汞化合物对脑神经的影响。这些影响是基于汞化合物与氨基酸、蛋白质、酶和细胞以及其他生命活性物质的作用。关于汞对脑神经毒性机理的研究也集中在无机汞和烷基汞化合物对脑损伤的机理探讨上2224。许多学者通过研究氯化汞和甲基汞使图9.13受HgGlu2作用的神经细胞的AFM成像神经元细胞菱形,显示已有突触生出图9.14受HgScu2作用的神经细胞的AFM成像有神经网络形成图9.11 受HgCys2作用的神经细胞的AFM成像细胞元
35、之间仍然呈现规律的排列,较之正常细胞的AFM图像边界更为清晰,显示乳鼠脑神经细胞受HgCys2作用有增大迹象图9.12受HgGlu2作用的神经细胞的AFM成像细胞元之间呈现规律的排列,较之正常细胞的AFM图像边界更为清晰，显示乳鼠脑神经细胞受HgGlu2作用有增大迹象蛋白质合成活性降低，脑细胞合成蛋白质氨基酸比例失调、细胞膜发生溶解而使细胞坏死以及造成脑神经传导和兴奋性能障碍等，阐述其中毒的机理2526。有的学者提出如下假说：甲基汞神经中毒的原发部位可能是细胞膜。甲基汞借助其亲脂性与蛋白质巯基结合，损害膜的渗透性，影响线粒体的功能，抑制了蛋白质的合成，使RNA含量减少，DNA不能正常复制；造成
36、神经系统酶和神经介质合成不足，破坏神经细胞正常代谢，从而使神经细胞萎缩、变性、坏死，并出现相应神经系统症状。只是上述假说还没有被直接证实。显然，有关机理最直观的证实方法是采用现代显微技术，在细胞或分子的水平直接观察汞化合物与细胞膜的图9.17不同汞化合物对神经元细胞高度、直径和细胞间距的影响表明： （1）不同汞化合物对脑神经细胞的作用大不相同；（2）氯化汞对神经细胞有显著的损坏；（3）三种含汞药效分子对神经细胞具有明显的兴奋作用结合和这种结合的部位，以及由此引起的神经细胞萎缩、变性和坏死的直观水平的图像。图9.15受HgScu2作用的神经细胞的AFM成像细胞连接紧密，可观察到突触形状图9.16
37、 HgCl2的毒性作用下神经细胞的AFM成像细胞明显变形，犹如砂砾安宫牛黄丸进入血液后的主要可溶性含汞成分为谷胱甘肽汞和半胱氨酸汞，安宫牛黄丸在胃液、肠液中的可溶性含汞成分为黄芩甙汞，有关化合物神经毒性的研究以及这些化合物和神经细胞作用的研究尚未见报道。利用原子力显微技术观察这种作用的结果，揭示汞的不同存在状态氯化汞、黄芩甙汞、谷胱甘肽汞和半胱氨酸汞的药理和毒理，科学地评价安宫牛黄丸的药效作用和安全性。扫描探针显微镜是迄今为止分辨率最高的显微技术，其中原子力显微镜可对导电和不导电样品都可在纳米水平进行直接的观测，已广泛用于生物样品的观测。近年来，在液晶分子、聚合物，或是蛋白质、抗原-抗体复合体
38、、DNA等化学或生物学领域中，利用STM和AFM观察分子结构颇为盛行。但是用STM或AFM研究这样巨大的分子结构，重现性都不好。因为要研究分子结构，首先必须要识别组成分子的原子的位置和种类。目前的STM或AFM虽然具有确定原子位置的能力，但还不具备严密地识别原子种类的能力。可以设想分子不仅仅是原子的集合体，而且是由具有不同化学特性的部分组成的集合体，即分子是由有特定化学性质的官能团集合在一起组成的。测定这一官能团的位置，即可研究分子的化学结构。如图所示，在AFM的针尖上固定化学传感分子，通常是通过共价结合修饰有机单层分子后的力显微镜探针针尖，其尖端具有良好控制的官能团，能够探测分子间相互作用并
39、利用其化学灵敏性来成像4。在化学传感分子和被测分子间存在特异性的化学相互作用力，测量这种化学相互作用力来成像的显微镜就称为化学力显微镜（CFM）（见图9.18）。图9.18 化学力显微镜（CFM）的概念图 CFM针尖的修饰十分重要，文献12对修饰技术的新进展作了综述，例如：用化学吸附法将传感分子固定于AFM探针上，在亲水衬底上化学吸附十八烷基三氯硅烷(CH3(CH2)17SiCl3，以下简写为OTS)，通过衬基表面的羰基及分子间相互反应，在衬底和分子间OTS形成硅氧烷键（Si-O-Si）结合的化学吸附单分子膜（CA膜）。在试验中将OTS和全氟三氯硅烷(CF3(CF2)7C2H4SiCl3，FS
40、-17)分别化学吸附于AFM的探针表面。在探针上形成CA膜的方法是在氮气中将微悬臂浸泡在约30mmol/l的OTS中，或浸在溶解FS-17的正十六烷、氯仿、四氯化碳的混合溶液中（重量比为2023），浸泡时间约两小时，然后用氯仿及纯水洗净。此外，还可以用下列四种方法来修饰AFM的针尖：1自组装单分子膜修饰AFM针尖首先在针尖上沉积一层钛或铬，厚度5-10nm，然后再沉积一层金膜，厚度50-70nm。金膜的厚度和沉积速率由石英晶体微天平监控，接下来的自组装过程与平面金基底的自组过程相同。这种修饰过的AFM针尖能用来定量测定基底和针尖自组装膜的尾部基团之间的粘滞力和摩擦力。2生物分子修饰AFM针尖将
41、生物分子对（如生物素和抗生素蛋白）分别修饰在基底表面和针尖上，通常有两种方法：（1）将生物分子直接修饰在AFM针尖上；（2）利用微球载体，首先在微球上涂一层薄的粘性物质，再把微球粘附于AFM针尖上，最后将生物分子修饰在微球上，形成功能化的AFM针尖。3. 碳纳米管AFM针尖碳纳米管具有化学惰性、各向异性：径向不导电、轴向导电，碳纳米管所具有的物理、化学性质使其非常适合作为AFM、STM针尖的载体，用化学方法在碳纳米管空腔内生长出Pt、Au等晶体，形成原子半径级针尖，既可以用作STM探针针尖，又可以用作AFM探针针尖。用碳纳米管做成的针尖具有非常高的空间分辨率。4. 修饰碳纳米管AFM针尖基于碳
42、纳米管AFM针尖所具有的独特的物理、化学性质，在碳纳米管针尖、碳纳米管上修饰上-COOH或-CONHR等功能基团，使针尖具有高度的化学敏感性。单个细胞的成像和观测分析及组分分析，是在细胞水平上了解生化反应的基本要求，单细胞的直径一般为5500m，体积为fLnL级，组分复杂（除无机物外还有核酸、蛋白质、酶、脂质和碳水化合物等），而且组分的含量极微（10-1510-21mol/L，即fmolzmol），则对分析技术提出具有高选择、高灵敏、快响应和超小体积的要求，且能在常温或低温下工作（要求在生理条件下），最好能进行活体（in vivo）、原位（in situ）、实时（real time）和在线（o
43、n line）分析的方法。AFM现已达原子级和分子级的分辨能力，能在天然条件或生理条件下工作，是当今最适合单细胞成像的观测研究的技术和方法。致谢: 衷心感谢国家自然科学基金委员会多年来对该研究工作的大力支持！ (袁倬斌*1, 2，张裕平2, 1，张君1. 1. 中国科学院研究生院应用化学研究所；2. 河南科技学院)参考文献1 Binnig G, Rohrer H. Gerber Ch. Appl. Phys. Lett., 1982, 40: 1782 白春礼. 扫描隧道显微术及其应用, 上海科技出版社, 19923 白春礼. 纳米科学与技术, 云南科技出版社, 19954 白春礼, 田芳,
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