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1、镉对小鼠肝脏毒性作用探讨摘要：目的 了解镉对小鼠肝脏的毒性作用，并探讨其对肝脏组织的毒作用机理。方法 健康成年清洁级昆明种小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，临用前以生理盐水配制CdCl2溶液，CdCl2染毒剂量分别为0.05、0.1、0.2mg/kg，染毒组小鼠皮下注射氯化镉溶液（10mg/kg体重），对照组注射生理盐水（10mg/kg体重），连续染毒三天，处死，取肝称重并制备肝匀浆，测量其肝脏系数、匀浆蛋白浓度、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和超氧化物歧化酶活性（SOD）及肝脏过氧化脂质讲解产物丙二醛（MAD）的活性。结果 染毒组小鼠上述各指标与对照组相比均有差异，但无统
2、计学意义。结论 尚不能论证镉对肝脏组织有损伤作用。关键词：镉；肝脏；毒性作用；小鼠引言：镉在环境中广泛持久存在,对人和动物造成极大的健康危害。急性镉暴露可损害机体多种靶器官组织。肝脏是镉急性中毒损伤的主要靶器官之一。鼠急性中毒后，镉主要蓄积于肝脏。镉有很强的亲硫性。在肝脏中，镉易与巯基结合而诱导金属硫蛋白生成镉-硫蛋白，因而金属硫蛋白对急性镉中毒有应急保护作用，但若镉在短期内大量转运到肝脏，便导致肝内金属硫蛋白相对不足，不能与镉有效结合而引起肝功能障碍，这可能是镉引起血清AST、ALT活性及MDA升高的原因之一【1】。通过本次实验了解镉对小鼠肝脏的毒作用，并探讨其对肝脏组织的毒作用机理，从而对
3、镉的毒性损害作用做出评价。1、材料与方法1.1实验试剂氯化镉（CdCl2、AR、中国上海新化工厂生产，GB1285-77，批号890401）、蒸馏水、0.9%生理盐水、蛋白浓度试剂（南京建成）、GOT测试剂盒（南京建成）、GPT测试剂盒（南京建成）、MDA测试剂盒（南京建成）、SOD测试剂盒（南京建成）。1.2实验仪器电子天平（感量 0.1g）、SIGMA 2K15型冷冻高速离心机、注射器、剪刀、镊子、滤纸、玻璃匀浆器、冰浴容器、水浴箱、量筒、烧杯、试管、移液管、移液枪、VIS-7220N型分光光度计。1.3实验动物健康成年清洁级昆明种小鼠40 只，雌雄各半，体重2027g，由福建医科大学动物
4、实验中心提供。1.4实验方法1.4.1分组与染毒将40只小鼠随机分为4组，临用前以生理盐水配制CdCl2溶液，CdCl2染毒剂量分别为0.05、0.1、0.2mg/kg，染毒组小鼠皮下注射氯化镉溶液（10mg/kg体重），对照组注射生理盐水（10mg/kg体重），每天定时称量体重后染毒，连续染毒三天。1.4.2处死与肝脏提取第4天分别称量小鼠体重后颈椎脱臼法处死，处死后立即取出肝脏并剥离周围脂肪及结缔组织，用生理盐水洗净后用滤纸吸干，称肝重，记录数据并计算脏器系数。1.4.3肝匀浆制备取肝组织0.2g，置于玻璃匀浆器中并加入2ml0.9%生理盐水，在冰水浴下研磨成10%肝匀浆，移至试管中并按小
5、鼠编号分别标号备用。1.4.4蛋白浓度、ALT、AST、MDA及SOD活性测定1.4.4.1取上述所制的肝匀浆用3000r/min离心15分钟，取其所得上清液备用0.1ml与0.9ml 0.9%生理盐水混合均匀备用。1.4.4.2蛋白浓度测定：采用Lorry法；ALT、AST测定：GOT、GPT检测试剂盒，比色法；MDA测定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法即MDA检测试剂盒，比色法；SOD测定：SOD检测试剂盒，比色法；脏器系数：称重法。1.5计算1.5.1肝匀浆蛋白浓度计算：蛋白质浓度=（测定管-空白管）/（标准管-空白管）标准管浓度（0.563g/L）1.5.2组织匀浆中总SOD活力计算：定
6、义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。计算公式：组织匀浆中SOD活力（U/mgprot）=（对照管吸光度-测定管吸光度）/对照管吸光度50%（反应液总体积/取样量（ml）待测样本蛋白浓度（mgprot/ml） mgprot为毫克蛋白数1.5.3组织中AST、ALT活力计算：组织中AST、ALT活力（U/mgprot）=通过标准曲线得的匀浆活力待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）1.5.4组织中MDA含量计算：组织中MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管OD值-标准空白管OD值）/（标准管OD值-标准空白管OD值）10(nm
7、ol/ml) 待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）1.5.5肝脏系数的计算：肝脏系数=肝脏重量（g）/体重（g）100%1.6实验数据处理与结论建立Excel数据库，分别输入各组实验数据，运用SPSS16.0 统计软件,采用方差分析法进行统计处理。表1 小鼠染毒前后体重差CdCl2(mg/kg)生理盐水合计0.0500.1000.2001-0.35-1.30-2.60-2.702-0.70-2.70-0.90-2.603-0.47-2.003.90-1.304-1.30-0.50-0.20-2.6051.023.50-1.200.8062.520.60-0.400.7071.600.900.
8、100.7081.501.10-1.500.3092.804.001.500.80103.291.600.100.80排除异常值之后例数101091039平均值0.9910000.520000-0.566667-0.5100000.125897标准差1.6182122.2039361.1640451.5947481.765236方差2.6186104.8573331.3550002.5432223.116056方差分析1变异来源SSdfMSFP总变异118.41038组间17.87735.9592.0750.05组内100.533352.872按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差
9、异无统计学意义（P0.05）。表2 四种方案处理后小鼠肝脏系数CdCl2(mg/kg)生理盐水0.0500.1000.20010.050.050.060.0520.060.070.050.0530.040.050.050.0540.050.050.050.0650.040.040.050.0560.060.050.060.0570.050.040.050.0780.050.050.050.0890.050.050.050.05100.050.040.060.06方差分析2变异来源SSdfMSFP总变异0.00217639组间0.00025730.0000861.6066580.05组内0.00
10、1919360.000053按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。 表3 四种方案处理后小鼠肝脏匀浆蛋白浓度（g/L）CdCl2(mg/kg)生理盐水合计0.0500.100.2013.3552.9622.3252.93726.0244.52810.6414.22330.7582.3425.9124.32846.8728.79111.7104.58457.6107.3389.2781.573610.0254.606-0.2825.12176.0744.3916.2732.58685.7025.0508.8607.27195.6606.5573.8955
11、.295103.5602.5904.8006.563排除异常值之后例数101091039平均值5.5644.9167.0774.4485.493标准差2.5452.1083.2031.7552.538673方差6.4774.44210.2603.0796.444862方差分析表3变异来源SSdfMSFP总变异244.90538组间36.88312.292.0680.05组内208.025355.94按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。 表4 四种方案处理后小鼠肝脏匀浆SOD活力值（U/mgprot）CdCl2(mg/kg)生理盐水合计0.0500.1
12、00.201-4.51434.2457.82231.48223.11415.1636.81120.0513126.04033.38515.96617.670414.9531.1598.77518.510512.7271.05110.85052.267610.15619.249-109.27918.540716.54121.66612.79832.663817.85414.31411.79213.452910.82017.18225.74517.2841029.50735.85520.93115.802排除异常值之后例数8109936平均值14.45919.32713.49920.60617.1
13、08标准差7.61612.5166.3346.7699.0019方差57.998156.66240.12245.81981.0344方差分析表4变异来源SSdfMSFP总变异2836.20335组间332.7253110.9081.41770.10组内2503.47783278.2337按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（P0.10）。图1表5 四种方案处理后小鼠肝脏匀浆AST酶活力（U/mgprot）CdCl2(mg/kg)生理盐水合计0.0500.1000.200146.93652.99070.50343.219221.98727.81317.47530.18
14、43205.77055.05825.70433.491422.983-0.97314.85430.200520.75526.02114.814-5.437 621.04329.839-303.55228.986724.76832.32523.74350.633825.68322.76318.90021.449929.05723.78342.47427.0901044.64744.38611.86422.389排除异常值之后例数999936平均值28.65134.99726.70331.96030.578标准差10.06912.52918.7919.47813.06226方差101.380156
15、.964353.11089.832170.6226方差分析5变异来源SSdfMSFP总变异5971.83335组间361.4973120.4990.6870.05组内5610.33632175.323按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。图2表6 四种方案处理后小鼠肝脏匀浆ALT酶活力（U/mgprot）CdCl2(mg/kg)生理盐水0.0500.1000.2001103.21888.711148.897110.047251.33549.85132.35272.2913427.836132.68174.22069.950449.5090.88228.
16、20164.512544.71041.32434.73220.826631.84763.228-551.51065.460749.67572.58550.411119.380852.83149.15935.41366.740958.97051.66077.33658.9681094.308105.70360.15248.032排除异常值之后例数91091038平均值59.60065.57860.19069.62163.950标准差23.48936.79837.94028.14631.14567方差551.7501354.1281439.451792.182970.0526方差分析6变异来源SS
17、dfMSFP总变异35891.94837组间645.6473215.21570.2080.05组内35246.301341036.6559按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。表7 四种方案处理后小鼠肝脏匀浆MDA含量（nmol/mgprot）CdCl2(mg/kg)生理盐水合计0.0500.1000.20011.22016.6622.8201.19420.9490.7890.9760.64637.4541.9961.0220.54041.4831.0781.8521.02050.7760.6991.4774.005 62.0343.045-41.98
18、31.15471.2400.7540.9421.20580.8541.8641.0701.25092.5130.6343.0011.006101.1670.7021.5021.039排除异常值之后例数999936平均值1.3601.2851.6291.0061.188标准差0.5740.8380.7880.2510.665437方差0.3290.7020.6210.0630.442806方差分析7变异来源SSdfMSFP总变异15.49835组间2.66630.8892.2860.05P0.10组内12.832320.389按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异无统计学意义（0.
19、05P0.10）。2、结果与结论本实验所得染毒前后体重差小鼠肝脏系数、肝脏匀浆蛋白浓度、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和超氧化物歧化酶活性（SOD）及肝脏过氧化脂质讲解产物丙二醛（MAD）的活性数据，按照方差分析法，各实验组之间及实验组和对照组比较差异均无统计学意义（P0.05），尚不能论证镉对肝脏组织有损伤作用。3、讨论镉是环境中广泛存在的有毒重金属元素之一，镉污染及其危害已是一个全球性的环境医学问题，急性镉暴露可损害机体多种靶器官组织，包括肝脏和肾脏等。一次性大剂量镉暴露引起的多器官损伤，在国内外已进行了广泛的研究。大量研究表明肝是急性镉暴露的主要靶器官，肝实质细胞的肿胀
20、、嗜酸性变、淋巴细胞的浸润及核固缩等镜下肝细胞损伤改变；AST、ALT及AP的活性明显升高的学生化改变。由于肝组织中所含的ALT浓度最高，肝损伤时，ALT释放到血液中，使血清ALT活力单位增高。一般来说，血清ALT活力单位增加越高，肝细胞损害的程度越大【2】。但是，本次试验数据结果经统计学方差分析F检验后均无统计学意义（P0.05），尚不能论证镉对肝脏组织有损伤作用，这个结论与预期实验结果不符，似乎意味着实验失败。作为实验者，应总结出本次实验的经验教训。1、实验参与人员众多，且各实验人员实验能力和知识水平参差不齐，实验过程大多实验者的心态没摆正，并没严谨负责地对待本次实验。建议应在实验准备阶段
21、先对实验人员进行规范的技能培训和积极的思想引导。2、小鼠雌雄比例不对，且从随机分组开始混乱，并未做到真正的完全随机化，将错就错。给鼠标记时标记不明确或褪色，导致后续多次乱号后加以猜测，影响实验数据的可靠性。3、连续染毒三天过程中，染毒剂量并未完全依据小鼠实际体重来注射，且注射亦存在未成功者；染毒过程存在未给予饲料及水实验组，实验因素控制不当。4、小鼠处死后亦有未及时剥离出肝组织，肝组织的剥离未完全者，肝组织剥离后未能及时研磨成肝匀浆，及时于冰浴中保存。肝匀浆的制作过程误差和错误并存。对各类试剂的使用并不了解，操作不熟练。5、整个实验过程应该有领导，有组织，有规范进行，这样才能不至于实验结果和预期实验结果偏差这么多。参考文献【1】 金惠英.急性镉中毒的肝脏损伤机制及金属硫蛋白的保护作用【J】 中华劳动卫生职业病杂志 1998.16 【2】 张文昌.李煌元.杨华.李昱辰预防医学基本技能训练实验教程 北京：人民卫生出版社 2007.06
