一种安全高效的血红蛋白纯化方法.doc

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1、檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏技术与方法一种安全高效的血红蛋白纯化方法*臧家涛 刘建仓 徐竞李东红 刘良明( 第三军医大学野战外科研究所 重庆400042 )摘要 目的: 建立一种适用于大量制备的，安全、高效的血红蛋白纯化方法。方法: 将压积红细胞装入透析袋，以含有还原剂的 Tris 缓冲液透析破碎，破碎的上清经两级硫酸铵沉淀后透析至上样 缓冲体系，离心后取上清即得血红蛋白提取液; 红细胞提取液通过阴离子交换 柱层析进一步分 离，计算回收率。纯化产物浓缩后以 SDS-PAGE 及 HPLC 鉴定纯度，进行紫外-可见光谱扫描并以 ABL800 血气分析仪分析血气指标，以鲎试剂测定内毒素含量，以磷测定法测

2、定脂质含量。结果: 血红蛋白提取液中脂质去除率 98% ，容易通过 0. 45m 滤膜; 经阴离子交换层析纯化的血红蛋白 经 SDS-PAGE( 银染法) 及 WB 分析没有杂蛋白条带，HPLC 分析纯度 99% 、总回收率 85% ; 内 毒素含量 2 EU，高铁血红蛋白含量 5% 。结论: 该血红蛋白纯化方法安全高效、成本低廉、易 于放大生产，具有较好的应用前景。关键词 血红蛋白 阴离子交换层析 硫酸铵沉淀 纯化中图分类号 Q513; Q939. 48; R394-33由于以人红细胞为载体的传统输血方法本身存在的交叉感染、输血反应及红细胞存储期短等问题，以无 基质血红蛋白为载体的新型携氧材

3、料 的 开 发，几 十 年 来一直是众多医学、科研工作者研究的主要内容之一。 在这个领域，发达国家处于领先的位置，有多个公司的 产品 进 入 III 期 临 床。 已有的以无基质血 红 蛋 白( hemoglobin，Hb) 为载体的携氧材料，包括分子内交联 血红 蛋 白1、脂 质 体 修饰的血红蛋 白2、聚 乙 二 醇( PEG) 修饰 的 血 红 蛋 白3、聚合物包裹的 血 红 蛋 白4 以及基因工程重组表达的血红蛋白5 等。除了基因工 程重组表达血 红 蛋 白 以 外，大 部 分 血 红 蛋 白 都 来 源 于 动物，包括牛、猪、人等。利用这些动物源血红蛋白，首 先需要将血红蛋白从红细胞

4、中分离纯化出来。已有的 血红 蛋 白 纯 化 方 法 包 括 超 滤 法6、加 热 法7、萃 取 法8、柱层析法9。加热法、萃取法对血红蛋白的空间 构象产生的影 响 不 可 避 免，且 萃 取 法 引 入 的 有 机 溶 剂 也是一种潜在 的 危 险 因 素; 超 滤 法 便 于 进 行 密 闭 的 流水线生产，为国外制药公司所广泛采用，但超滤膜需要经常更换，成本高昂，势必限制血红蛋白携氧产品的推 广应用; 柱层析 法 成 本 低、重 复 性 好，对血红蛋白的空 间结构没有影响，安全高效，是最有前景的血红蛋白纯 化方法。目前文献报道的血红蛋白纯化方法多采用阴离子 交换柱层析法，将压积红细胞低渗

5、破碎 并 高 速 离 心 取 上清，再通过阴离子交换柱 纯 化。本实验室在采用上 述方法小规模纯化血红蛋白时并未发 现 问 题，但 在 放 大生产时发现两个比较严 重 的 问 题。首 先，红 细 胞 膜 脂质含量很高，通过离心红细胞破碎液 的 方 式 难 以 去 除脂质。脂质与阴离子交换 填 料 结 合 紧 密，降 低 了 柱 效，因此通常每上样等柱床体积量的压 积 红 细 胞 必 须 执行一次柱清洁程序。柱清洁程序耗费大量乙醇和冰醋酸，不但提 高 了 成 本，而且延长了生产周期。其 次，红细胞破碎液难以直接通过 0. 45m 滤膜，频繁的滤膜更 换 过 程 增 加 了 高 铁 血 红 蛋 白

6、 ( methemoglobin，metHb) 的含量。本研究拟解 决 上 述 问 题，建 立 一 种 安全高效的血红蛋白纯化方法。收稿日期: 2011 -07 -01修回日期: 2011 -08 -15* 国家“973 ”计划资助项目( 2005 CB522601 )通讯作者，电子信箱: liangmingliu yahoo com檪檪殏檪檪殏及搭载 300SB-C3 反相柱的 Agilent 1200 高效液相色谱1材料与方法( high performance liquid chromatography，HPLC)进行分1. 1主要试剂与仪器猪红细胞，从农户饲养家猪采集; 硫 酸 铵，重

7、 庆 博析; 血红蛋白氧合状态通过紫 外-可 见 光 谱 扫 描、ABL800 血气分析 仪 进 行 分 析，主 要 考 察 metHb 含 量;通过免疫印迹法( Western blot，WB) 进行定性分析; 通 过鲎试剂测定内毒素含量，定磷法测定脂质含量。1. 3数据处理数据为多次测 定 后 采 用 s 表 示，本 方 法 与 一 般艺化学试剂有限公司; 低温高速离心机，Jouan MR23i;截留分子质量 5 14kDa 透析袋，重庆万利实验器材有 限 公 司; 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准，Fermentas 公 司; Q Sepharose Fast Flow 填料，GE 公

8、司; 超滤杯，截留分子质 量 30kDa 超滤膜，上海摩速科学技术有限公司; 猪血红 蛋白标准品，Sigma 公 司; 兔抗猪血红蛋白多 克 隆 抗 体 SC-22718，Santa Cruz 公司; 300SB-C3 反相柱( 4. 6 * 250 mm) ，1200 高效液相色谱仪，Agilent 公司; ABL800 血气 分析仪，雷度公司; 鲎试剂，厦门市鲎试剂厂。方法在除去脂质效果方面的比较采用单因素方差分析与 t 检验。2结果2. 1硫酸铵分级沉淀血红蛋白以 SDS-PAGE 分析沉淀前后蛋白质溶液蛋白质组1. 21. 2. 1实验方法硫酸铵分 级沉淀血红蛋白将猪压积红细胞 成的变

9、化，结果见图 1。以氰化亚铁试剂盒测定硫酸铵分级沉淀前后血红蛋白浓度，计 算 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 法 的血红蛋白回 收 率; 以中国药典纪录的 定 磷 法 测 定 脂 质含量，各项参数见表 1。结果表明，经过硫酸铵分级 沉淀的血红蛋白溶液，杂蛋白得到有效的去除，从而简 化阴离子交 换层析步骤的操作。脂质得到有效的去 除，避免了频繁的清洗阴离子交换填料的过程，节约了 时间，同时降低了成本。另外，经过硫酸铵分级沉淀以 后的蛋白质溶液易于通过 0. 45m 滤膜，有效的避免了 由于频繁更换滤膜引起 metHb 含量升高的现象。100ml 转入透析袋，放入装有 10mmol / L Tris、

10、0. 15% 抗坏血酸 ( m / v) ，pH 8. 0 缓冲液的 1L 标本 皿 中，4 透 析 3h，1h 换 液 1 次。将破碎的红细胞转入 50ml 离 心 管，边加边搅拌加入研磨的硫酸铵粉末，使其终饱和度 达到 0 时饱和度为 20% ，4 10 000g 离心 10min; 将 上层漂 浮 物 移 去，然 后 将 中 间层蛋白液转移到新的 50ml 离心管。向新离心管中的蛋白液加入硫酸铵粉末 使其终饱和度达到 0 时饱和度 46% ，4 4 000g 离心10min; 将上层液体弃 去，以 Binding Buffer ( 脱 氧 的25mmol / L Tris，10mmol

11、/ L NaCl，pH8. 5) 洗涤沉淀 2 次 后重悬沉淀。将硫酸铵沉淀的血红蛋白液转入透析袋， 以 Binding Buffer 为透析液于 4 进行透析，每 1h 换液 一次，共 3 次。将透析后的血红蛋白溶液按体积比 1 2 以 Binding Buffer 稀 释，4 12 000g 离 心 10min。将 离 心上清以 0. 45m 滤膜过滤后，进行阴离子交换层析。1. 2. 2 阴离子交 换柱层析法纯化血红蛋白 以 去 离 子 ddH2 O 冲洗柱床体积为 50mm 200mm( d h) 的 Qsapharose Fast Flow 层析纯化柱 5 倍柱 床 体 积，以 2

12、倍 柱床体积的 Binding Buffer 平衡柱后将以步骤 1. 2. 1 制 备的血红蛋白提取液调节 pH 至 8. 5 后上样，上样完成 后以 Binding Buffer 再平衡 2 倍柱 床 体 积，最 后 以 脱 氧 的 25mmol / L Tris、80mmol / L NaCl ( pH 8. 5 ) 洗 脱 血 红 蛋白，流速皆 为 10ml / min。纯化产物以氩气加压的超 滤杯( 超滤膜截留分子质量 30kDa) 超滤浓缩。1. 2. 3 纯化血红 蛋 白 的 鉴 定 血红蛋白纯度以十二 烷基 磺 酸 钠-聚 丙烯酰铵凝胶电泳 ( sodium dodecyl su

13、lfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE ) 以图 1 SDS-PAGE 分析硫酸铵分级沉淀前后蛋白质组成变化Fig. 1 SDS-PAGE result for hemoglobin extract before and after ammonium sulfate precipitationM: Standard molecule weight protein; C: Hemoglobin extract beforeprecipitation; D: Hemoglobin extract after precipitation表

14、1 血红蛋白硫酸铵分级沉淀各项参数表Table 1 Parameters for ammonium sulfate precipitation of hemoglobinHPLC 分析结果见图 3，经过硫酸铵沉淀制备的血红蛋白提取 液 中 Hb 的 纯 度 已 经 接 近 Sigma 公 司 的 标 准品图 3( a) 、( b) ，杂峰少而且拖尾峰不明显，显示 不但纯度提高，而且血红蛋白一级结构未受到破坏，但 血红蛋白异构体去除还不完全图 3( c) 、( d) ; 经过阴 离子柱层析纯化后血红蛋白质含量为 99. 8% ，血 红 蛋 白异构体也基本去除图 3 ( e) 、( f) ，达到进

15、行下一步 实验的要求。紫外光谱扫描结果见图 4，光谱图像显示 纯化产物中 大 部 分 Hb 处 于 氧 合 状 态，且 在 540nm 及590nm 处吸收峰明显，提示携氧功能正常; 另外经血气 分析仪测试，纯化 Hb 中 metHb 含量 5% ，显示纯化过 程中 Hb 得到保护免于受到氧化破坏。阴离子交换层析纯化的血红蛋白的各项参数见表2，均符合中国药典关于生物制品的要求。项目常规方法a本方法血红蛋白回收率脂质含量通过 0. 45 m 滤膜 90 %100 %困难 85 % 2 % b容易a Conventional method:packed red blood cells were l

16、ysed bydiluting with ddH2 O，and the supernatant was removed into new tubesfor further purification after high speed centrifugation; b Lipid proteinswere effectively removed in hemoglobin extracts obtained by ammonium sulfate precipitation compared with conventional method，P 0. 01 2. 2阴离子交换柱层析纯化血红蛋白经

17、过硫酸铵 分 级沉淀处理的血红蛋白溶液，以 阴 离子交换柱层析纯化，产物纯度以 SDS-PAGE( 银染法) 及 HPLC 鉴定。SDS-PAGE 结 果 显 示图 2 ( a ) ，通 过 本方法纯化的血红蛋白 纯 度 较 高，优 于 Sigma 标 准 品 ( 纯度 98% ) ; 纯化血红蛋白与标准品在约 32kDa 处皆有蛋白质条带，进行 WB 分析以鉴定该蛋白质成分图 2( b) ，结果显示分子质量约为 16kDa 和 32kDa 的 蛋白质 条带都是血红蛋白，目前推测分子质量约为 32kDa 的蛋白质条带由血红蛋白 、 亚基自身交联形 成，是否如此还需要进一步验证。表 2 阴离子交

18、换层析纯化的猪血红蛋白参数表Table 2 Parameters of purified porcine hemoglobin by anion exchange chromatography项目参数6 ( 0. 1 ) % 99 %90 ( 5 ) % 5 % 95 % 2 EU / ml 3. 3 nm / ml7. 3 0. 1血红蛋白浓度血红蛋白纯度 血红蛋白回收率 高铁血红蛋白含量 氧合血红蛋白含量 内毒素含量磷脂含量pH3讨论以无基质血红蛋白为基础的新型携氧材料，经过几十年来众多研究者的不懈努力，已经趋于成熟。在南非 等某些地区，已经有一些医院与医药公司合作开展临床 应用10。尽管

19、无基质血红蛋白携氧载体进入全面应用仍需进一步研究与完善，但其光明前景值得人们期待。在无基质血红蛋白携氧材料的开发与应用等各个方面，国外都处于遥遥领先的位置。为了便于进行规模化、标准化生产，国外公司多采用密闭流水线，以超滤膜结合各 级过滤滤芯生产无基质血红蛋白11。由于红细胞膜脂 质含量非常高，在进行过滤、超滤的过程中滤膜极易堵 塞，需要对各级滤芯进行频繁的清洗，超滤膜也需要经常 更换。因此这种生产方法成本极高，对大规模应用造成 困难。对于国内，情况更是如此，因为超滤膜及各种滤芯 严重依赖进口。因此，一种低成本的、便于进行标准化的 无基质血红蛋白制备方法，具有重要意义。图 2 SDS-PAGE

20、及 WB 分析阴离子交换柱层析纯化血红蛋白的纯度Fig. 2 Purity of the hemoglobin purified by anion exchange chromotography by SDS-PAGE and WB( a ) SDS-PAGE result by silver stain; M: Standard molecule weightprotein; 1: Porcine hemoglobin standard from Sigma; 2: Hemoglobin purified by anion exchange chromatography ( b ) West

21、ern blot for hemoglobin purified by anion exchange chromatography，both the 16kDa and 32kDa protein bound with the anti-hemoglobin IgG specifically图 3 HPLC 分析纯化血红蛋白纯度Fig. 3 Purity analysis result of purified hemoglobin by HPLC( a) ，( b ) Sigma porcine hemoglobin standard ( nominal purity 98 % )( c )

22、，( d ) unpurified porcine hemoglobin ( e ) ，( f ) purifiedhemoglobin ( a) ，( c) and ( e) were spectrum from VWD detector，and ( b) ，( d) and ( f) were from fluorescence detector Samples wereanalyzed by the Agilent 1200 HPLC system with a Zorbax 300 Extend-C18 column ( 4. 6 * 250 mm) at 25 and a guard

23、 column was used。Samples of 5 ( l each were injected by the auto-sampler and signals were monitored by the VWD ( 254 nm) and the FLD ( EX = 250 nm，EM= 340 nm) detector Acetonitrile containing 0. 1 % TFA ( a) and ddH2 O containing 0. 1 % acetonitrile ( b) were used as the mobile phase following the g

24、radient as 40 % 5 min，40 % 42 % 5 min，42 % 5 min，42 % 45 % 5 min，45 % 5 min，45 % 60 % 5 min and 60 % 80 %5 min at the flow rate of 1 ml / min In the acidic mobile phase hemoglobin dissociated into peak iii in ( a) ，( c) ，( e) and peak ii in ( b) ， ( d) ，( f) ，( peak i in all spectrums) subunits and

25、the heme peak ii in ( a) ，( c) ，( e) There was another peak iv in ( a) ，( c) ，( e) and iii in ( b) ，( d) ，( f) which was found to be a hemoglobin isoform corresponding to the 32 kDa strap in SDS-PAGE图 4 猪 Hb 标准品及纯化样品的紫外-可见光扫描光谱Fig. 4 UV-Vis spectrums of porcine hemoglobin standard and purified hemog

26、lobin( a) UV-Vis spectrum of porcine hemoglobin standard ( Sigma) ( b) UV-Vis spectrum of purified porcine hemoglobin All samples were diluted by 25 mmol / L Tris pH 7. 4 and then scanning was performed in the range of 200 600 nm with the( c ) UV-Vis spectrum of hemoglobin reported by other research

27、ers ，-and- - representedinterval of 2 nmoxyhemoglobin，deoxyhemoglobin and carbonmonoxy ferrous hemoglobin respectively脂质由于其特殊的结构，通 过 常 规 的 离 心 方 式 难以去除。使用有机溶剂萃取 的方法可以去除脂质，但 有机溶剂的引入有可能造成血红蛋白 的 变 性，尤 其 是 残留的有机溶剂对生物体的伤害以及对离子交换填料 的损伤。如果要通过离心的 方式去除脂质及磷脂，必 须改变红细胞破碎液的密度，从 而 使 血 红 蛋 白 与 脂 质 在离心过程中处于不同的位置。硫酸

28、铵沉淀法是常用 的蛋白质粗分 离 方 法，但在研究初期我 们 用 这 种 方 法去除脂质的效 果 并 不 理 想，后 来 发 现 原 因 在 于 红 细 胞破碎的方式。目前报道的红细胞破碎采用的方法是将 压积红细胞以蒸馏水稀释，造 成 低 渗 环 境。但 在 此 过 程中蛋白质浓 度 降 低，其密度不足以使 脂 质 与 血 红 蛋 白处于离心管中的不同位置。我们研究的解决方法是 将压积红细 胞 装 入 透 析 袋 中，以含有抗坏血酸的 Tris 盐酸缓冲液透析破碎，然后加入硫酸铵进行分级沉淀。 结果证明此方法不但有效地去除了脂质，控 制 了 高 铁 血红蛋白的含量，而且由于红细胞破碎液体积减小

29、，耗 费的硫酸铵量控制在最小，进一步控制了成本。本研究解决了阴离子交换柱层析法纯化血红蛋白的 其中两个重要问题，没有引入有害成分，且产物纯度、血 红蛋白回收率都比较高，是一种安全高效的血红蛋白纯 化方法。但阴离子交换柱层析法进行血红蛋白纯化也有 一些需要解决的问题，比如不易进行密闭的流水线生产， 产品质量稳定性比超滤法低等，这都是进一步研究方向。( 47 ) : 12551 -12561 2 Kaneda S，Ishizuka T，Goto H，et al Liposome-Encapsulated Hemoglobin，TRM-645 : Current Status of the Deve

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37、gery，Third Military Medical University，Chongqing 400042 ，China)Objective: To build up a hemoglobin purification method which could meet the needs of safety，Abstractefficiency and scale amplification Methods: Packed red blood cells were lysed by dialyzing against 10 mmol / LTris-HCl ( pH 8. 0) contai

38、ning 0. 15% ( M / V) ascorbic acid at 4 for 3 h with the buffer changed once an hour，and then centrifuged at 10 000 g for 10 min ( 4 ) The supernatant was treated with ammonium sulfate by the two-step salting-out operation to the saturation of 20% and 46% ( M / V，calibrated at 0 ) subsequently，and t

39、hen the precipitated protein was re-suspended using the equalizing buffer ( 25 mmol / L Tris，10 mmol / L NaCl pH 8. 5) with the equal volume to that of the packed red blood cells After dialyzing against the equalizing buffer for at 4 for 3 h with the same changing interval，the protein solution was d

40、iluted with the equalizing buffer by the ration of 1 2 ( V / V) and centrifuged at 12 000 g for 20 min ( 4 ) The supernatant after centrifugation，namely the rough hemoglobin extract，was loaded to an 50 mm * 200 mm ( d * h) Q sapharose FF anion exchange chromatography column pre-equalized with the eq

41、ualizing buffer and then hemoglobin was eluted using 25 mmol / L Tris，80 mmol / L NaCl pH 8. 5 The purity of samples from different processed was analyzed by SDS-PAGE and HPLC，and the oxygen-binding status was characterized by the UV-Vis spectrum scanning and blood-gas indexes，which were provided by

42、 the Thermo Multiscan Spectrum and ABL800 Flex Blood-gas Analyzer respectively Lipoprotein concentration was tested by the phosphorus determination method and LPS was determined using the stachypleus amebocyte lysate with the sensitivity of 0. 3 EU / ml，0. 1 EU / ml and 0. 03 EU / ml Results more th

43、an 98% lipids were removed in the rough hemoglobin extracts compared with hemoglobin extracts prepared by the conventionalmethod，and this rough hemoglobin extracts could easily go through the 0. 45 m cellulose nitrate membraneIn thefollowing anion exchange chromatography process，it could be observed

44、 that column contaminants were efficientlyremoved by the two-step ammonium sulfate precipitation No other protein but hemoglobin could be detected in the hemoglobin purified by anion exchange chromatography through SDS-PAGE ( silver staining) and WB，and HPLC analysis indicated a purity of above 99%

45、The total recovery of hemoglobin in the anion exchange chromatography was above 85% ，and most hemoglobin molecules were in the ferrous oxyhemoglobin status and methemoglobin was less than 5% in the purified hemoglobin revealed by UV-Vis spectrum scanning and blood-gas determination LPS was less than 2EU / ml Conclusion: The hemoglobin purification method introduced above could meet the need of safety，efficiency，cost control and amplification，and a good application could be expected in the futureKey wordsPurificationHemoglobinAnion exchange chromatographyAmmonium sulfate pre