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1、HIF-1基因12外显子序列生物信息学分析张翠翠作者简介：张翠翠（1986-），女（汉族），硕士研究生，Email:zczcui369，联系电话：0312-7528343通讯作者：贾青（1964-），男（汉族），教授，博士，研究方向：动物遗传育种Email:jiaqing，贾 青1.2，邢增喜1,魏星灿1，陶隽1（1、河北农业大学动物科技学院，河北 保定071000；2、国家北方山区农业工程技术研究中心， 河北 保定 071000）摘要：为了探讨不同物种的HIF-1基因遗传多样性,使用生物信息学方法分析人、家鼠、猪、牛及猕猴等10个物种的HIF-1基因的12外显子序列。结果显示，选取的10个物
2、种44条序列中共筛查到130个多态位点，生成13种单倍型。牦牛、家牛和猪三个物种HIF-1基因12外显子区域存在较为丰富的遗传多样性，而狨、人、猕猴、家鼠和犬五个物种的HIF-1基因12外显子相对保守。关键字：物种；HIF-1基因；遗传多样性；生物信息学Bioinformatics Analysis of the 12th exon of HIF-1GeneCuicuiZhang1 QingJia1、2, ZengxiXing1, XingcanWei1, Jun Tao 1（1、College of Animal Science and Technology, Agricultural Un
3、iversity of Hebei, Baoding, 071000,China;2 、National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Area, Baoding, 071000, China）Abstract: This study aims to discuss the genetic diversity of the alpha subunit of hypoxia inducible factor 1(HIF-1a). The 12th exon of ten species ar
4、e analyzed by Bioinformatics methods, such as Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Macaca mulatta and so on. The result shows that 130 polymorphic sites were detected and 13 hapolotypes were sorted from 44 sequences of 10 species. There were rich genetic diversity of the 12th exon of the HIF-1 a
5、gene within and among three species, Bos grunniens Bos taurus and Sus scrofa. But Canis, Homo sapiens, Macaca mulatta, and Callithrix jacchuss were conservation.Key words: species; HIF-1 a gene; genetic diversity; bioinformatics低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是细胞缺氧后产生的一种适应性的DNA结合蛋白，由亚基和亚基组成，
6、亚基受低氧诱导，既是HIF-1的活性亚基又是调节亚基。HIF-1 对能被受低氧所诱导的低氧反应性基因(Hypoxia Responsive Genes，HRG)具有调控作用，如促红细胞生成素( EPO)，糖酵解代谢酶，血管内皮生长因子(VEGF)，葡萄糖转移子(Glut)等在内的多种基因。这些基因序列有着共同的特点，即其增强子或启动子上存在一个低氧反应元件，是由HIF-1结合点(核心序列为 5-CGTG- 3)及其两侧的功能序列构成的1、2。当丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶、烯醇化酶等和包括这些酶的启动子转录激活时，低氧诱导因子结合位点被暴露，HIF-1通过激活这些位点来激活这些酶基因3，进而诱导E
7、PO、糖酵解酶等的合成，促进糖酵解的进行，通过糖酵解产生ATP供机体能量代谢的需要。有关HIF-1遗传多态性的研究更多集中于某物种中，而在物种间的研究极少，另外应用该基因探讨物种间系统进化关系的报道也较为少见。本研究运用生物信息学方法分析牦牛、家牛、狨、人、猕猴、家鼠、大鼠、藏羚羊、猪和犬物种间的遗传多态性，及这些物种间的系统进化关系，希望能为今后的研究提供理论依据。1 材料和方法1.1 基因序列来源 从National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中查询下载不同物种的HIF-1基因的编码序列，其中包含牦牛、家牛、狨、人、猕猴、家鼠
8、、大鼠、藏羚羊、猪和犬10个物种的44条序列（见表1）。表1 不同物种的HIF-1基因序列来源Table 1 The source of sequences for HIF-1 in different species物种Species序列数Sample size序列号Access number牦牛 (Bos grunniens)2AY621118、DQ838046家牛 (Bos taurus)2AB018398、NM174339狨属 (Callithrix jacchus)3XM002753990、XM002753989、XM002753988犬 (Canis)9XM847185、XM860
9、420、XM860386、AY455802、XM86286、XM860313、XM537471、XM860335、XM860401人 (Homo sapiens)14NM001530、BC012527、HSU22431、AF207602、AF207601、AF208487、AF304431、AB500182、AB385144、BT009776、AY890352、NM181054、FJ790247、AB073325猕猴 (Macaca mulatta)5XM001099149、XM002805060、XM002805061、XM002805059、XM001098939家鼠(Mus muscul
10、us)5MMU59496.1、NM0104312.2、AF003695.1、X95580.1、BC26139.1藏羚羊(Panthlolps hodqsonii )1AY971808.1大鼠（Rattus norvegicus）1Y09507.1猪 (Sus scrofa)2NW_003299341.1、AK3442041.2 分析方法首先使用BioEdit 软件将下载的44个不同物种序列的HIF-1基因编码区比对分析，其共有序列为425bp，然后利用 DanSP 5.10软件对所得结果进行遗传多样性分析，生成单倍型，并计算出遗传距离。最后利用MEGA4.1软件的UPGMA方法对所得结果进行聚
11、类分析，构建系统发育树。2 结果与分析2.1 不同物种HIF-1基因核苷酸多样性2.1.1 多态位点分析在所分析的共有片段为425bp的44条序列中，共筛查到130个多态位点，比率占30.59%，其中单一多态位点11个；简约多态位点119个。不同物种内的多态位点数也各不相同（见表2），其中狨、犬、人、猕猴四个物种的HIF-1基因核苷酸多态位点为零，说明他们的HIF-1基因12外显子序列保守性强。表2 不同物种HIF-1基因序列多态信息Table 2 Polymorphic information of HIF-1 in different species物种Species多态位点数Number
12、 of polymorphic sites突变总数Total number of mutations单一多态位点Singleton variable sites简约多态位点Parsimony informative sites牦牛(Bos grunniens)2220家牛(Bos taurus)1110狨(Callithrix jacchus)0000犬(Canis)0000人(Homo sapiens)0000猕猴(Macaca mulatta)0000家鼠(Mus musculus)2211猪(Sus scrofa)22202.1.2 单倍型及其多样性44条HIF-1基因序列中共生成13种
13、单倍型。不同物种的单倍型数目也不尽相同(表3)，牦牛和猪的核苷酸多样性、平均核苷酸差异数目最大，其次是家牛和家鼠，而猕猴、犬、人、狨单倍型只有一种。说明牦牛和猪两物种中HIF-1基因存在较为丰富的遗传多样性。表3 不同物种HIF-1基因的单倍型多样性Table 3 Haplotype diversity of HIF-1in different species物种序列数N单倍型数h单倍型多样性Hd核苷酸多样性Pi平均核苷酸差异数K家牛(Bos taurus)2210.002511.000牦牛(Bos grunniens)2210.005032.000猕猴(Macaca mulatta)5100
14、0犬(Canis)91000人(Homo sapiens)141000狨(Callithrix jacchus)31000家鼠(Mus musculus)530.80.002511.000猪(Sus scrofa)2210.005032.000N, 序列数; Np, 单倍型数; Hd 单倍型多样性; K, 平均核苷酸差异数目; Pi, 核苷酸多样性N, Number of sequences; h, No. of haplotype; Hd, Haplotype diversity;K, average number of nucleotide differences; Pi, Nucleot
15、ide diversity2.1.3 物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化各种群间核苷酸歧异度(Dxy) 在0.003770.22312之间，净遗传距离在0.000000.21683之间，遗传分化在-0.142861.0000之间(表四)，不同物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化的变化范围相对都很大，其中人和猕猴以及家牛和牦牛间的核苷酸歧异度、净遗传距离均最小，说明人与猕猴的亲缘关系、家牛与牦牛的亲缘关系较近，而鼠与其它物种间的核苷酸歧异度和净遗传距离均最大，说明大鼠与本研究中其他物种的亲缘关系较远。表4 不同物种核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化Table 4 Nucleotide
16、divergence, net genetic distance and genetic differentiation of haplotype in different species不同物种Sus_scrofaBos_grunniensBos_tauruscallithrixcanishomo_sapiensmacacaMus_musculusSus_scrofa0.064070.064070.115580.077890.105530.110550.19925Bos_grunniens0.0691000.128140.090450.115580.120600.21935Bos_tauru
17、s0.067840.003770.128140.090450.115580.120600.21683Callithrix0.118090.130650.129400.105530.022610.027640.17261canis0.080400.092960 .091710.105530.097990.103020.19020homo_sapiens0.108040.118090.116830.022610 .097990.005030.17010macaca0.113070.123120.121860.027640.103020.005030.17010Mus_musculus0.20302
18、0.223120.219350.173870 .191460 .17136 0.17136上三角为净遗传距离(Da)，下三角为核苷酸歧异度(Dxy)Above diagonal is net genetic distance(Da)；below diagonal is nucleotide divergence(Dxy) 2.3 不同物种HIF-1基因遗传分化分析根据不同物种之间核苷酸奇异度（Dxy），用MEGA4.0 软件的UPGMA方法构建不同物种分子聚类图（图1）。根据聚类图分析得出，牦牛与家牛首先聚为一类，再与猪聚为一类，然后与犬聚为一类；人与猕猴先聚为一类再与狨聚为一类，这两大类聚合
19、后再与家鼠聚合。这说明牦牛与家牛的亲缘关系较近，人与猕猴的亲缘关系较近，而家鼠与其他物种的亲缘关系是最远的。图1 根据物种间的遗传分化构建的聚类图Figure1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of species3 讨论HIF-1是一种调节蛋白，亚基被认为是HIF-1所特有的、受缺氧调控的亚基，在常氧状态下，HIF-1无活性，缺氧环境中与亚基(HIF-1)结合, 进而表现其活性促进糖酵解酶转录增加。该基因的研究多集中在疾病和耐低氧方面，C1772T和G1790A位点研究较多4-6，此两个位点均位于12外显子上，其突变型能显
20、著性提高HIF-1a的转录激活能力。人和猪HIF-1a基因的编码蛋白相似度较高为95%，其结构包括bHLH、PAS、氧依赖降解区（ODD）、N、C端反式激活域（NTAD、CTAD）。其中ODD的531-601区段富含Thr残基，与HIF-1快速降解密切相关；576-785区段位于NTAD和CTAD之间，属于抑制结构域（ID），抑制HIF-1a在常氧状态下的转录活性7。本研究中发现，不同物种HIF-1基因12外显子上筛出的多态位点包含人C1772T、A1790G两位点，这个多态位点与耐低氧能力和一些疾病相关，而其他128个位点SNPs作用机理还需要进一步研究验证。该10个物种中家牛、牦牛和猪的单
21、倍型多样性为1，说明这3个物种的HIF-1遗传多样性高，遗传资源丰富；而猕猴、犬、人和狨四个物种HIF-112外显子较为保守。另外，计算出的不同物种间核苷酸歧异度和净遗传距离比较大，说明不同物种间遗传分化已十分明显。不同物种的44条HIF-1基因序列构建的聚类图中说明，牦牛与家牛的亲缘关系较近，人与猕猴的亲缘关系也较近，而家鼠与其他物种的亲缘关系是最远的，此结果与动物分类学及人们对动物进化的认识基本一致8。HIF-1基因12外显子处于氧依赖降解区和抑制结构域，在低氧状态下，其多态性可能会造成基因的不稳定进而引发一系列反应，使机体适应环境的变化，而物种间不同的多态位点能够证明哪些物种可以适应在低
22、氧环境中生存，哪些物种更适应于常氧环境中生存，具体的多态位点值得继续深入研究。参考文献1 Semenza GL. HIF-1 and human disease: one highly involved factor J. Genes Dev,2000,14:1983-1991.2 Jiang, BH, Rue E, Wang, GL, et al. Dimerization, DNA binding and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1J. Biol. Chem, 1996,271:17771-17778.3
23、 Riddle SR, Ahmad A, Ahmad S, et al. Hypoxia induces hexokinase II gene expression in human lung cell line A549J. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2000,278(2):L407-16.4 Tanimoto K, Yo shiga K, Eguchi H, et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha polymorphisms associated with enhanced transactivation c
24、apacity, implying clinical significance J. Car Cinogenesis, 2003, 24 (11):1779-1783.5 刘海平,胡扬,许春燕.中国北方汉族人群低氧诱导因子-1a基因C1772T 多态性研究J.浙江大学学报,2008,37(3):267-270.6 Tongfeng Zhao, Jing Lv, Jiangpei Zhao, Marius Nzekebaloudou. Hypoxia-inducible factor-1 gene polymorphisms and cancer risk: a meta-analysisJ.
25、Clinical Cancer Research.2009,28:159.7 Ruas JL, P oellinger L, Pereira T. Functional analysis of hypoxia-inducible factor-1-mediated transactivation. Identification of amino acid residues critical for transcriptional activation and/or interaction with CREB-binding protein J. J Biol Chem, 2002, 277(41):38723-38730.8 郭平仲.群体遗传学导论M.北京:农业出版社, 1993: 298-332.
