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1、- 13 -细胞培养完整手册常用设备 准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放置未消毒物品)、储品柜(放置消毒过的物品)、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、 PH 计(测量培养用液 PH 值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。培养室的设备: 液氮罐、储品柜(存放杂物)、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱( -80 )、空调、二氧化碳缸瓶、边台(书写实验记录)。必须放在无菌间的设备:离心机(收集细胞)、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱(孵育培养物)、水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4 冰箱(放置 serum 和培养用液)。无菌操作基
2、本技术 无菌室的灭菌:1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用 3 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 过氧乙酸擦拭。2.CO2 孵箱(培养箱)灭菌:先用 3 新洁尔灭擦拭,然后用 75 酒精擦拭或者 0.5 过氧乙酸,再用紫外灯照射。3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。4.实验后灭菌:用 75 酒精( 3 新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 5.定期检测下列项目:钢瓶之CO2 压力;CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换);无菌操作台内之airflow 压力,定期更
3、换紫外线灯管及HEPA 过滤膜,预滤网(300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750),定期更换水槽的水。实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。 2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 酒精棉球擦净双手。 无菌操作的演示: 1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 酒精擦拭瓶子的外表面 2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌 4.继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 6.吸取两种以上的
4、使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。 器械的清洗和消毒 玻璃器械洗消: 一、新的玻璃器皿的洗消: 1.自来水刷洗,除去灰尘。 2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入 5 稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。 3.刷洗、烘干: 12 小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。 4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g :浓硫酸 200ml :蒸馏水 1000ml )浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次,最后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。 5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。6.高压消毒:包装好的器皿装
5、入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向 15 磅 时,维持 20-30 分钟。 7.高压消毒后烘干 二、旧的玻璃器皿的洗消: 1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。 2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液(酸液), 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗 3 次。 3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖
6、子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向 15 磅 时,调节电开关维持 20-30 分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上) 5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用 75 酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压( 30 分钟)消毒,再烘干备用。 橡胶和塑料: 橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏
7、水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 2.胶塞烘干后用 2 氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟(用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 3.胶帽,离心管帽烘干后只能在 2
8、 氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。 4.胶头可用 75 酒精浸泡 5 分钟,然后紫外照射后使用即可。 5.塑料培养瓶,培养板,冻存管.6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用 70 酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用 23 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生
9、混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻 (CoC126H2o) 2g ,30盐酸 10m 1,蒸馏水 88m1 。注意事项: 1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。 2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡: A. 泡酸时要戴耐酸手套,防止酸
10、液溅起伤害人体。 B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止 泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。 具体步骤:一、水的制备: 细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。二、PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ,如: Hanks , D-Hanks 液的配制 ) :1.溶解定容:将药品( NaCl 8.0g , KCl 0.2g , Na2HPO4H2O 1.56g , KH2P
11、O40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ,摇匀即成新配制的 PBS 溶液。 2.移入溶液瓶内待消毒:将 PBS 倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒: 胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在 pH 为 8.0 、温度为 37 时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,
12、以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ,如: D-Hanks 液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。 1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右)或 PBS ( D-hanks )液中。搅拌混匀,置于 4 内过夜。 2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器( 0.22 微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20 保存以备使用。四、抗生
13、素溶液的配制1.所用纯净水(双蒸水)需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。 2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶,用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶,加 5ml 灭菌双蒸水,即每毫升各为 20 万单位。 3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位 1 微克? 4.细胞库之细胞培养基不加抗生素 5.培养自ATC引进之细胞株,培养基中不加抗生素。6.培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通 过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。7.寄
14、送活细胞时,须将培养液充满整个 flask 时,则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +streptomycin 100 ug/ml) 8.若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加gentamicin,因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 注意混合使用后药物毒性会增强。10.抗生素使用种类与浓度:工作浓度. 储存
15、温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20 G(+) bacteria streptomycin 100 ug/ml -20G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria gentamicin 50 ug/ml -20 G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20 yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20 yeast and molds fungi
16、zone 2.5ug/ml -20 yeast and molds 五、RPMI1640 的制备与消毒:1.溶解、调 PH 值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ,摇匀。 2.安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和
17、支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 3.抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。4.分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4 冰箱内待用。 5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液( 4 时两周有效)。六、血清: 1.血清的灭火:细胞培养常用的是小牛血清,新买来的血清要在 56 水浴中灭火 30 分钟后,再经过抽滤方可加入培养基中使用。 血清必须贮存于20 -70,若存放于4,请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶,可将4045 ml 分装于无菌50 ml 离心管中,由于血清结冻时体积会增加约10 %,必须预留此膨胀体积之空
18、间,否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2.一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。 3.瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 或70 至4冰箱溶解一天,至室 温下全溶后再分装,一般 50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 ,使温度与成分均一,减少沈淀的发生。勿直接由 直接 至 解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4.heat-inactivation 是指56 , 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是
19、使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须,一般建议作此热处理,因为会造成沈淀物之显著增多,且会影响血清之品质。补体参与之反应有:cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagytosis, chemotaxis and activation of lymphytic and macrophage cell type。5.勿将血清置于太久,若在 放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳
20、定之成份亦会因此受到破坏,而影响血清之品质。 6.血清之沉淀物 6.1 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。6.2 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点 ,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在中欲培养此微生物“,但在3
21、7 环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品应立即停用,更换另一批号的血清。七、HEPES 溶液: HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸( N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid )。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓 度为 10-50mmol/L ,一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。 1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下:准确称取 HEPTS
22、238.3g ,加入新鲜三蒸水定容至 1L 。过滤除菌,分装后 4 保存。 注意:因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶,所以可根据实际情况灵活配制,但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如:称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中,过滤除菌后可完全( 20ml )加入 1L 培养液中,或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。 八、谷氨酰胺: 合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,其作用非常重要,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺
23、在溶液中很不稳定, 4 下放置 1 周可分解 50 ,故应单独配制,置于 -20 冰箱中保存,用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4 冰箱中储存 2 周以上时,应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存,用时加入培养液。配制方法为,谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加至 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液,充分搅拌溶解后,过滤除菌,分装小瓶, -20 保存,使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。 九、肝素溶液的配制: 含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培养液中最
24、终浓度为 50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠,包装为约为 0.56 克 / 瓶,配制时,可将其溶于 100ml 三蒸水中,定容,过夜,然后过滤除菌,分装小瓶,保存温度为 。使用时,向 100ml 培养液中加入 1ml (精确可加入 0.9ml )即可。 十、型胶原酶: 0.1 型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意:因为 型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20 保存。 十一 、明胶溶液: 因为明胶难于过滤,所以配制 0.1 明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量
25、 0.1 克 (配成 100ml 溶液) 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液,明胶也难溶,因此要充分摇匀,过夜放置,然后无菌分装入 50ml 小瓶中, 4 保存。注意事项: 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张,放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方,并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清,而小牛血清略偏酸性,为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ,可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展
26、细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试,具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低
27、的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置 4的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基。如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞
28、进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的 PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Imm
29、ortality)而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?196,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中。在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入 37水中,使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 细胞原代培养 一、原理将动物机体的各种组织
30、从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用 EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 ?uD3 二、仪器、材料及试剂仪器:培养箱(调整至 37),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37)材料:胎鼠或新生鼠试剂:1640培养基(含 20%小牛血清),0.25%胰酶,Hanks液,碘酒三、操作步骤(一)胰酶消化法1、器材:将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置 75%酒精泡 23秒钟(时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将
31、新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中。2、用 Hanks液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔组织,血液等杂物。附:Hanks液配方:5m KH2PO4 0.06g,Nacl 8.0g,NaHCO3 0.35g,KCl 0.4g,葡萄糖 1.0g,Na2HPO4H2O 0.06g,加 H2O至 1000mlG1 注:Hanks液可以高压灭菌。4下保存。3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用 Hanks液洗三次,转移至小青霉素瓶中。4、视组织块量加入 56倍的 0.25%胰酶液,37中消化 2040分钟,每隔 5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。5、加入 35ml培养液以终止胰酶消化作
32、用(或加入胰酶抑制剂)。6、静置 510分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。7、1000rpm,离心 10分钟,弃上清液。8、加入 Hanks液 5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。9、加入培养液 l2 ml(视细胞量),血球计数板计数。10、将细胞调整到 5105/ml左右,转移至 25ml细胞培养瓶中,37下培养。上述消化分离的方法是最基本的方法,在该方法的基础上,可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酶等)。(二)组织块直接培养法自上方法第 3步后,将组织块转移到培养瓶,贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培
33、养液勿接触组织块。入 37静置 35小时,轻轻翻转培养瓶,使组织浸入培养液中(勿使组织漂起),37继续培养。四、注意事项1、自取材开始,保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。2、在超净台中,组织细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发。3、凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入。细胞传代培养(消化法)一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能
34、分瓶。二、材料和试剂1.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于20 ,使用前放在37 水槽回温。 3.新鲜培养基4.无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤(1)传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅
35、内预热。 2.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。(2)胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意
36、消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37。 2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。(3)吹打分散细胞:1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。(4)分装稀释细胞:1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入
37、适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5105/ml。最后要做好标记。(5)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个,占50为,占75时为。*不同类型细胞操作*(1)附着型胞(adherent cell) 1.吸掉旧培养液。2.用D-PBS 洗涤细胞一至二次。3.加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 作用数分钟,于倒立显微镜下观察,当细胞
38、将要分离而呈现圆粒状时,吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA,则在 trypsin-EDTA trypsin作用后,加入适量含血清 之新鲜培养基终止作用,离心后再吸掉上清液。4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。(2)悬浮型细胞(suspension cell) 1.吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。2.吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。(3) 融合瘤(hyb
39、ridoma)有些 hybridoma cell需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分殖至新培养瓶中。*传代细胞培养注意事项*1.严格的无菌操作 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附:EDTA(0.02乙二胺四乙酸二钠)消化液配方:EDTA 0.20g,NaCl 8.00g, KCl 0.20g, KH2PO4 0.02g,
40、葡萄糖 2.00g,0.5酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌,使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培养瓶要彻底清洗,否则再培养时细胞容易脱壁。 细胞计数及活力测定一、原理培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber 中细刻9个1mm正方形再细刻16 个小格,深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻
41、片后,每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml 中之细胞数目。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。存活测试之步骤为dye exclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Ery
42、throsin bluish 。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球计数盘及盖玻片(Hemytometer and coverslip) 计数器(co
43、unter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 三、操作步骤(一)细胞计数3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100 倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。3.3. 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blu
44、e等体积混合),最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 3.4. 若不用血球计数盘,可用Coulter counter 作自动计数,惟无法辨别死细胞或活细 胞。然后按下式计算:细胞数/ml4大格细胞总数x 2/ 410000注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占 10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。(二)细胞活力1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色 2一 3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。4、镜下取几个任意视野分
45、别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。范例:T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液,取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之 细胞数目。 活细胞数/方格:55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格:5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml:60.75 x 104 x 2
46、= 1.22 x 106 细胞数 /flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率:225/24392.6 % (三)MTT法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。l、细胞悬液以 1000rpm离心 10分钟,弃上清液。2、沉淀加入 0.51ml MTT,吹打成悬液。3、37下保温 2小时。4、加入 45 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。5、1000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计 570nm比色,酸化异丙醇调零点。注意:MTT法只能测定细胞相对数
47、和相对活力,不能测定细胞绝对数。附:1、0.4%台盼兰染液配制:台盼兰 0.4克 加双蒸水至 100 ml。Cbeqe 2、MTT配制:MTT 0.5克,溶于 100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4下保存。3、酸化异丙醇配制:异丙醇中加入 HCl使最终达 0.04mol/L。细胞的冷冻保存1.注意事项: 1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 90 致密度。1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久,低温损伤主要发生在这一温度区内,是“危险温区”。1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micron FGLP T