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1、人脐带血树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞 体外诱导及鉴定陈琛1,江振友1,于斌2,高永鹏1,陈孝银25(1. 暨南大学医学院微生物与免疫学系,广州 510632;2. 暨南大学医学院中医系,广州 510632) 摘要:目的:建立从人外周血体外诱导扩增树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞的方法。方法: 从正常人脐带血中分离出单核细胞,经三种细胞因子重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因 子(rh GM-CSF) 、重组人白细胞介素 4 (rh IL-4) 和重组人肿瘤坏死因子(rh TNF-) 联10合诱导培养,7 天后收获细胞,并利用光学显微镜、免疫组化的方法进行鉴定。结果:培养收 获了高纯度的树突状细胞、
2、巨噬细胞、单核细胞,细胞高水平表达 CD1a、CD86 、CD68 和 CD14。结论:人脐带血单核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞。关键词:关树突状细胞;巨噬细胞;单核细胞;脐带血15中图分类号:R730.45Inducing and Identification of Dendritic Cells, Macrophages and Monocytes from Human Cord Blood in VitroCHEN Chen1, JIANG Zhenyou1, YU Bin2, GAO Yongpeng1, CHEN Xiaoyin220(1.
3、Medical of Microbiology and Immunology, School of Medical, Jinan Unversity, GuangZhou 510632;2. Department of Traditional Chinese Medicine, Shool of Medical, Jinan University, GuangZhou 510632)Abstract: Objective: To establish a method in vitro from human cord blood for get dendritic cells,25macroph
4、ages, and monocytes. Methods: Three immune cells which isolated from human cordblood, can be induced by three cytokines - Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (rh GM-CSF), recombinant human interleukin-4 (rh IL-4) and recombinanthuman tumor necrosis factor (rh TNF-), an
5、d after 7 days we can harvest cells. Then we coulduse optical microscopy, and immunohistochemical methods to identify cells. RESULTS: A large30number of high purity dendritic cell, macrophages and monocytes were generated. Cells expressedhigh level of CD1a and CD86, CD68 and CD14. Conclusion: A larg
6、e number of mature dendritic cells, macrophages, and monocytes can be induced by cytokines from human cord blood mononuclear cells in vitro.Keywords:dendritic cells; macrophage; monocytes; cord blood350引言机体的免疫反应决定着疾病的发生、发展和转归,而免疫反应的产生首先是由抗原递呈 细胞(Antigen presenting cell, APC)经加工处理后将抗原信息传递给 T、B 淋巴细胞而引
7、发 特异性免疫应答。抗原递呈细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、B 细胞等。由于树突状细胞可40以直接激活初始 T 细胞,同时产生一系列细胞因子和化学因子参与机体的免疫调节,因此 认为树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞,能摄取和加工抗原,特征性的高水 平表达 CD1a,CD83,CD86 等。巨噬细胞是连接先天性和获得性免疫应答的桥梁,通过产 生多种细胞因子和趋化因子发挥着重要作用。近年来研究发现,DC、巨噬细胞、单核细胞基金项目:国家自然科学基金(30973693)作者简介:陈琛,(1984- ),女,在读硕士,主要从事病原微生物的研究通信联系人:江振友,(1963- ),男,教授,主要
8、从事微生物学研究. E-mail: tjzhy已经成为当前病毒感染研究的热点之一。我们从人脐带血中分离诱导出 DC、巨噬细胞和单45核细胞,为免疫细胞的后续研究奠定了基础。1材料与方法1.1 材料rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-购自美国 Peprotech 公司,淋巴细胞分离液购自天津灏洋 生物制品科技有限公司,兔抗人 CD1a、CD14、CD68、CD86 单克隆抗体购自美国 BD 公司,50免疫组化试剂盒、荧光二体 FITC 购自北京博奥森生物有限公司,瑞氏-姬姆萨染色剂购自南 京建成生物有限公司,RPMI1640 购自 GIBICO 公司,胎牛血清购自杭州四季青公司。1.2
9、方法人脐带血分离 无菌取新鲜人脐带血,肝素抗凝。用生理盐水 1:1 比例稀释后缓慢沿离 心管管壁加到事先回到室温的淋巴细胞分离液上,分离液与稀释后血液的比例为 1:1。离55心(2500rpm/min,20min)取中间白色云雾层细胞,PBS 洗涤 2 次(1500g/min,5min)以去除血小 板, pH7.2 的 RPMI 1640 洗涤 1 次(800g/min,8min),再用 RPMI 1640 完全培养基悬浮细胞, 得外周血单个核细胞 (PBMC) ,用含 10% 胎 牛血清的 RPMI 1640 培养液(含 RPMI1640,Herpes10mmol/L, 青 霉 素、链 霉素
10、 各 100U/ml , 10% 胎牛 血清) 调整细 胞 数2106/ml,,加入 6 孔板,每孔 2ml,37 5% CO2 培养箱培养 6h。60树突状细胞诱导 单个核细胞 37 5% CO2 培养箱培养 6h 后吸弃上清,用 PBS 轻洗 2次,去除非粘附细胞,每孔加入含 10%胎牛血清的 1640 培养液 2ml 及刺激因子 hGM-CSF、hIL-4(终浓度 hGM-CSF 100ng/ml, hIL-4 50ng/ml),置 37 5% CO2 培养箱继续培养,每隔2d 半量换液,加入全量细胞因子。于第 5d,加入 TNF-,终浓度为 100ng/ml,进一步刺激 树突状细胞成熟
11、。每日在倒置相差显微镜下观察,培养 710d 收集细胞并鉴定。65巨噬细胞诱导 单个核细胞 37 5% CO2 培养箱培养 6h 后吸弃上清,用 PBS 轻洗 2 次, 去除非粘附细胞,每孔加入含 10%胎牛血清的 1640 培养液 2ml 及刺激因子 hGM-CSF(终 浓度 100ng/ml),置 37 5% CO2 培养箱继续培养,每隔 2d 半量换液,加入全量细胞因子。 于第 7d 收集细胞并鉴定。单核细胞培养 单个核细胞 37 5% CO2 培养箱培养 6h 后吸弃上清,用 PBS 轻洗 2 次,70去除非粘附细胞,每孔加入含 10%胎牛血清的 1640 培养液 2ml 不加刺激因子
12、的情况下,分 离后的贴壁细胞即为单核细胞。用免疫组织化学方法鉴定免疫细胞 分别使用兔抗人 CD1a、CD86 单克隆抗体鉴定树突 状细胞;兔抗人 CD68 单克隆抗体鉴定巨噬细胞;兔抗人 CD14 单克隆抗体鉴定单核细胞。 操作步骤如下:细胞接种在玻片(用多聚赖氨酸处理)上,-20冷丙酮固定 10min 后,0.6%75过氧化氢甲醇溶液室温下孵育 10min 以阻断内源性过氧化物酶活性,滴加正常羊血清封闭液 室温 20min,倾去血清后滴加兔抗人单克隆抗体,置湿盒内 4过夜,过夜后 37复温 45min, PBS 冲洗 3min3 次,滴加生物素化二抗工作液,室温孵育 20min,PBS 冲洗
13、 3min3 次,滴 加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育 20min ,PBS 冲洗 3min3 次。DAB 显色,光 镜下观察反应 20min。流水清洗后,苏木素复染,常规酒精梯度(70%、80%、90%酒精 5min180次,95%酒精 5min2 次,100%酒精 5min3 次)脱水,二甲苯透明,树胶封片。PBS 代替一抗作阴性对照。用间接免疫荧光染色方法鉴定免疫细胞 分别使用兔抗人 CD1a、CD86 单克隆抗体鉴定树突状细胞;兔抗人 CD68 单克隆抗体鉴定巨噬细胞;兔抗人 CD14 单克隆抗体鉴定单核细 胞。操作步骤同免疫组化方法,操作步骤如下:细胞爬片的制作同前,将培养有细
14、胞的盖玻85片从培养液中取出,使用 PBS 液轻轻冲洗,把含血清的培养液冲净。4冷丙酮固定 10min, PBS 冲洗 3min3 次,边洗边振荡,滴加未标记的一抗液,置湿盒内 4过夜,过夜后 37 复温 45min,PBS 冲洗 3min3 次,滴加荧光素 FITC 标记羊抗兔 IgG,室温孵育 1h,PBS 冲洗 3min3 次,自然晾干玻片周围水份并甩掉细胞上的水分,细胞面向下,树胶封片,荧 光显微镜观察。902结果2.1 人脐带血分离健康人脐带血分离细胞贴壁培养 6h 后获得的贴壁细胞即为单核细胞。倒置相差显微镜 下观察,见图 1。95100图1 倒置相差显微镜下单核细胞(200)Fi
15、g. 1 Monocytes under the inverted phase contrast microscope (200)2.2 树突状细胞诱导单核细胞用 100ng/ml rh GM-CSF、50ng/ml rh IL-4 诱导培养 2d,倒置相差显微镜下观 察,发现单个核细胞聚集成为散在分布、类似克隆的细胞聚体,聚体不断增大,第 6d 大部分细 胞悬浮,体积较大,形状不规则,并且有毛刺状突起,细胞刚从培养箱中取出时,突起多且长(图2A、B)。105110115120125A:culture of DC for 6 days; B:negative control of immuno
16、histochemistry: DC with PBS as monoclonal antibody;C: negative control of immunofluorescence: DC with PBS as monoclonal antibody; D: immunohistochemistry: DC with CD1a as monoclonal antibody; E: immunofluorescence: DC with CD1a as monoclonal antibody; F: immunohistochemistry : DC with CD86 as monocl
17、onal antibody; G: immunofluorescence: DC with CD1a as monoclonal antibody.图2 树突状细胞培养及鉴定(200)Fig. 2 Isolation and identification of DC(200)2.3 巨噬细胞诱导单核细胞用 100ng/ml rhGM-CSF 诱导 7d 后,倒置相差显微镜下观察,得到的巨噬细胞 呈贴壁生长。贴壁细胞伸展,牢固黏附,体积明显增大,从不规则形逐渐变成椭圆形,呈煎蛋状, 少数呈长梭形,细胞间可有部分融合(见图 3A)。A:culture of macrophages for 6 da
18、ys; B:negative control of immunohistochemistry: macrophages with PBS as monoclonal antibody; C:immunohistochemistry : macrophages with CD68 as monoclonal antibody; D:immunofluorescence: macrophages with CD68 as monoclonal antibody; E: negative control of immunofluorescence: macrophages with PBS as m
19、onoclonal antibody.图3 巨噬细胞培养及鉴定(200)Fig. 3 Isolation and identification of macrophages (200)2.4 单核细胞培养单核细胞经 RPMI 1640 完全培养基培养 5d 后得到单核细胞。见图 4A。130135A:culture of monocytes for 6 days; B:negative control of immunohistochemistry: monocytes with PBS asmonoclonal antibody; C:immunohistochemistry : monoc
20、ytes with CD14 as monoclonal antibody; D:immunofluorescence: monocytes with CD14 as monoclonal antibody; E: negative control of immunofluorescence:monocytes with PBS as monoclonal antibody.图4 单核细胞培养及鉴定(200)Fig. 3 Isolation and identification of monocytes (200)1401451501552.5 免疫组化方法对免疫细胞进行鉴定图 2 显示树突状
21、细胞形态不规则,表面有大量突起,细胞胞质内出现颗粒状红色产物为 CD1a 阳性细胞占细胞总数的 90%95%(图 2B),荧光染色阳性反应(图 2C);颗粒状蓝色产 物为 CD86 阳性细胞(图 2D),荧光染色阳性反应(图 2E)。图 3 显示巨噬细胞呈贴壁生长,伸展,细胞胞质内出现颗粒状红色产物为 CD68 阳性细 胞(图 3C),荧光染色阳性反应(图 3D)。图 4 显示单核细胞体积较大, 呈圆形, 周边光滑,细胞胞质内出现颗粒状红色产物为CD14 阳性细胞(图 4C),荧光染色阳性反应(图 4D)。3结论树突状细胞是目前已知的体内功能最强的专职抗原提呈细胞,被称为机体防御病原微生 物侵
22、袭的重要“哨兵”, DC 与机体的免疫调节功能密切相关, 参与了肿瘤、自身免疫性疾病 及免疫耐受等的发生发展1。当机体遭遇病原微生物侵袭时,树突状细胞能很快获得这些信 息,将这些信息及时传递给免疫系统,并将病原微生物从体内清除出去2。有实验表明,与外周 血单个核细胞前体的 DC 相比, 脐血 DC 的表面标记表达相对稳定3。细胞表面高水平表达 HLA-DR、CD1、CD80 、CD83 和 CD864。巨噬细胞是三大专职抗原提呈细胞之一,具有广泛的生物学效应,如抗感染、抗肿瘤、参 与免疫应答和免疫调节等,是参与非特异和特异性免疫的重要细胞。GM2CSF 诱导的巨噬细 胞与肺泡巨噬细胞有相似的功
23、能及表型特点5,6,7因此,该法体外培养的巨噬细胞可作为人 肺泡巨噬细胞的体外模型,对呼吸系统疾病的研究具有重要价值。该法培养的树突状细胞、巨噬细胞单核细胞在体外具有生物学活性,纯度较高,而且来源 于人体,可作为体外免疫试验的材料,简易而实用。160165170参考文献 (References)1 Liu Y J. IPC. Professional Type 1 Interferon- Producing Cells and Plasmacytoid Dendritic Cell Precursors J. Annu.Rev. Immunol, 2005, 23: 275- 306.2 李罗
24、清,孙升刚,曹学兵等.未成熟树突状细胞对 T 细胞功能及其 IL-10 和 TGF-b1 表达的影响.免疫学杂志,2011,27(2):122-125.3 何海新,叶韵斌,陈强等.脐血来源树突状细胞的培养与鉴定 J.福建医药杂志,2005,27(2):112-115.4 王媛,杨爱珍,陈惠英等.人外周血树突状细胞的体外诱导和鉴定 J.临床肿瘤学杂志,2004,9(6):597-600.5 Wegrowski Y, Milard A L, Kotlarz G, et al. Cell surface proteogly can expression during maturation of hu
25、man monocytes-derived dendritic cells and macrophages J. Clin Exp Immunol, 2006, 144(3): 485-493.6 Akagawa K S, Komuro I, Kanazawa H, et al. Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-inducedhuman monocyte-derived macrophages J. Respirology, 2006, 11(1): 32-36.7 Lehtonen A, Ahlfors H, Veckman V. Gene expression profiling during differentiation of human monocytes to macrophages or dendritic cells J. J Leukoc Biol, 2007, 82(3): 710-720.