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1、检测分析通 过DHA藻 粉 的18S rDNA序 列 验 证 藻 油脂肪酸组成推断 DHA微 藻 属 名常桂芳1，2 ，柴丹1 ，戴小军1 ，田桂尾1 ，王兴国2( 1. 丰益( 上海) 生物技术研发中心有限公司，上海 200137; 2. 江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122)摘要: 我国卫生部批准为新资源食品的 DHA 藻油包括产自裂壶藻 ( Schizochytrium sp. ) 、吾肯氏壶藻( Ulkenia ameoboida ) 和 寇 氏 隐 甲 藻 ( Crypthecodinium cohnii ) 。 通过对几种商品 DHA 藻 粉 的18S rDNA 进行扩增、
2、测序和比对，结合藻油的脂肪酸组成，对藻油的生产藻种进行了鉴定。结果表明，基于 18S rDNA 序列分析数据建立的系统进化树可进一步确定 DHA 微藻属名。关键词: DHA; 裂壶藻; 吾肯氏壶藻; 寇氏隐甲藻; 脂肪酸组成; 18S rDNA中图分类号: TS222; Q949 2文献标志码: A文章编号: 1003 7969( 2012) 09 0080 05To deduce DHA microalgae species from fatty acid composition of algaloil through 18S rDNA sequence analysis of DHA al
3、gal powderCHANG Guifang1，2 ，CHAI Dan1 ，DAI Xiaojun1 ，TIAN Guiwei1 ，WANG Xingguo2( 1 Wilmar R D ( Shanghai) Center Co ，Ltd ，Shanghai 200137，China; 2 School of FoodScience and Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China)Abstract: DHA algal oil approved as novel food by Chinese Ministry o
4、f Health should be derived fromSchizochytrium sp ，Ulkenia ameoboida and Crypthecodinium cohnii The microalgae species were identi-fied through 18S rDNA amplification，sequence analysis and comparison from commercial algal powdercombined with the fatty acid composition of algal oil The results showed
5、that phylogenetic tree based on18S rDNA sequence could further confirm the DHA producing microalgae speciesKey words: DHA; Schizochytrium sp ; Ulkenia ameoboida; Crypthecodinium cohnii; fatty acid composi-tion; 18S rDNADHA 是人类大脑和视网膜组织中细胞膜 的 组成成分，对婴幼儿视觉和神经系统的发育有至关重要的作用，同时它在预防高血压、动脉硬化、关节炎 以及癌症等疾病方面具有显
6、著功效1。2010 年 3 月我国卫生部批准了裂壶藻、吾肯氏 壶藻、寇氏隐甲藻所产 DHA 藻 油为新资源食品。2011 年 3 月发酵法所产 DHA 油脂的食品安全国家 标准 GB 264002011 予以发布。2012 年 3 月我国 卫生 部 出 台 了食 品 营 养 强化剂使用标准 GB148802012，批准了这三类微藻所产 DHA 油 脂 可用于婴幼儿配方食品。随着各项食品安全法规的逐渐出台，非常需要 建立科学易行的微藻鉴定方法，帮助用户企业选用合法安全的 DHA 藻油。传统的菌种鉴定分类方法限于简单的形态学特征以及生理生化特征，必需活2体细胞。常桂 芳 等 比对了各种藻油的脂肪酸
7、组 成，提出 可通过藻油的 脂肪酸组成来推断商品化 DHA 藻油的微 藻 属 名。随 着 现 代 分子生物学技术 在菌种鉴定应用中逐渐深入，藉 此 方 法 对 藻 粉 18S rDNA 的克隆、测序和比对，期望验证通过脂肪酸组 成鉴定藻种的正确性。材料与方法主要材料在中国市场收集 3 个不同来源的 DHA 藻粉样1收稿日期: 2011 12 25; 修回日期: 2012 05 16作者简介: 常桂 芳 ( 1972 ) ，女，在 读 博 士，主 要 从 事 粮 食、油脂 及 植 物 蛋 白 方 面 的 研 究 工 作 ( E-mail) coolskyjsyx1. 1品，编号为 S1、S2 和
8、 S3。163 com。Agilent 7890 气 相 色 谱 仪，烘 箱，水 浴 锅，Bio Rad PCR 仪，Multimage 凝胶成像 系 统 ( 阿 尔 法 生物技术公司) ，电泳仪。正己烷、氢氧化钾、盐酸为分析纯，甲醇 为 色 谱 纯，PCR Clean up System( Promega，Lot# 184504 ) ， pMD19 T Simple Vector( TaKaRa，Lot# D104A) ，扩 增用 Ex Taq DNA polymerase( TaKaRa，Lot# DRR001) ， DNA Sequencer ( ABI PRISMTM 377XL) 。
9、5 GATATCTTCCTCTAAACAATAAGTTC3 ; 16Su:5GTAGTCATATGCTTGTCTC3 和 16Sd: 5 TCCGCAGGTTCACCTACGGA3。PCR 扩 增 程 序 参 数 为:95 5 min，循环 1 次; 95 30 s，64 30 s，72 2min，循环 10 次; 95 30 s，50 30 s，72 2 min，循环 10 次; 95 30 s，55 30 s，72 2 min，循环15 次; 72 10 min 循环 1 次; 最后以 16 循环 1 次结束4; 扩增产物 1% 琼脂糖凝胶电泳分离后，回收0. 6 2 kbp 之间的条带，
10、通过凝胶回收试剂盒( Pro-mega，USA) 回收，然后根据操作说明将纯化的适量 DNA 片段连 接 至 pMD19 T 载 体 上。重 组 质 粒 转化至 DH5 宿主细胞中，提取质粒验证 后 送 至 美 季生物 测 序，其 序 列 在 NCBI ( National Center for Bio-technology Information) 数据库中使用 BLAST 工具进行比 较 分 析。相 似 性 大 于 97% 的 核 酸 数 据，通 过MEGA 软 件 ( 版 本 4. 0 ) 制 作 Neighbor Joining 进化树5。2结果与讨论1. 2气相色谱分析条件色谱柱:
11、CP Sil 88，50. 0m 250m 0. 20m; 载气: 氢气; 检测器: 火焰离子检测器( FID) ; 进样口 温 度: 250 ; 程 序 升 温: 80 保 持 2 min，以10 / min 的速率升到 120 ，再以 5 / min 的速率升到 180 ，保持 2 min 后，以速率为 2 / min 升温到 205 ，最 后 在 230 保 持 5 min; 检 测 器 温 度:360 ; 分流比: 75 1; 进样量: 1 L。用标样保留时间定性，峰面积归一化法计算各脂肪酸组分相对含量。3 种藻油脂肪酸组成3 种藻油脂肪酸组成见表 1。其 中 S1 藻 油 含C16
12、0 51. 4% ，DHA 32. 8% ，DPA 7. 0% ，DHA 与DPA 含量比值 为 4. 69。根 据 文 献2可 以 推 断 S1是裂 壶 藻 属，较 为 接 近 Schizochytrium limacinum 或2. 11. 3藻油提取和分析称取 1 g 干藻粉，加 7 mL 20% 盐酸，在 75 水浴振荡 40 min，然后用 40 mL 正己烷萃取，油脂层再通过真空旋转蒸发器除去正己烷得到 DHA 藻 油。称取约 0. 3 g DHA 藻油置于 8 mL 样品瓶中，依次加入 5 mL 正己烷、3 mL 0. 05% 氢氧化钾 甲醇溶液，放在 60 烘箱里反应 20 m
13、in，振摇均匀，离心后，取上清液进气相色谱仪分析。1. 418S rDNA 的扩增根据 李 明 刚3 的 CTAB 法提取藻粉基因组 DNA，使用通用 18S 及 16S rDNA 保守引物扩增样品藻 粉 的 rDNA 核 酸，所 用 引 物 为 18Su: 5 GCGGCCGCGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAT3 和 18Sd:Schizochytrium mangrovei。S2 藻油含 C16 0 24. 9% ，DHA 36. 5% ，DPA 11. 4% ，DHA 与 DPA 含量比值为3. 20，可以推断 S2 是裂壶藻属，较为靠近 Schizochy-trium s
14、pATCC20888 或 Schizochytrium aggregatum。S3藻 油 含C16 0 17. 7% ，DHA 49. 1% ，DPA20. 5% ，DHA 与 DPA 含量比值为 2. 40，可以推断 S3是 裂 壶 藻 属， 较 为 靠 近Schizochytrium spATCC20888 或 Schizochytrium aggregatum。表 1 S1，S2，S3 3 种藻油脂肪酸组成%藻粉C140C160C161C180C181C182C183C204C205C225C226S1S2S35. 517. 07. 751. 424. 917. 70. 23. 60.
15、11. 50. 60. 5tr1. 40. 10. 4trtrtrtr0. 30. 60. 50. 20. 60. 30. 27. 011. 420. 532. 836. 549. 1注: “tr”表示未检出。2. 2 18S rDNA从 3 个藻粉中通过 PCR 扩增得到 18S rDNA 基因，凝胶回收 产 物 1% 琼脂糖凝胶电泳结果如图 1所示。未能通过 16S rDNA 保守区通用引物扩增得 到特异性的 PCR 产物。推测这 3 株微藻均 为 真 核生物。2. 318S rDNA 序列分析根据 pMD19 T 上 通 用 引 物 M13 ( 47 ) / M13注: 1 为核酸 Ma
16、rker，2 4 分别为 S1、S2 和 S3 的 18S rDNA。图 1 3 个藻粉的 18S rDNA 扩增结果电泳图( 48) 对 插入序列进行测序 ，得 到 S1 、S 2 和 S3 微序列进行距离计算，构建的 NJ 系统进化树见图 2、藻的 18S rDNA 序列。将所得 18S rDNA 序列分别在Genbank 数据中进行 BLAST 分析，结果表明 S1 与已有数据最大相似值达 97% ，为 Schizochytrium limaci-num( accession No. HM042910. 2 ) ; S2、S3 与 已 有 数图 3 和图 4。从进化树种可以看出，S1 与
17、 Schizochy-FJU 512 具有最近的亲缘关系，而 S2、S3trium sp两者与 Schizochytrium sp ATCC20888 具 有 最 为 紧密的同源关系。这与通过藻油脂肪酸组成所推测的微藻属名一致。据 最 大 相 似 值 达 99% ，均 为Schizochytrium spATCC20888 ( accessionNo. DQ367050 ) 。 用MEGA4. 0 软件 对 Genbank 中 相 似 性 大 于 97% 18S rDNA图 2 基于 S1 微藻 18S rDNA 的系统进化树准确性应该更可靠，因为其对比范围更广。由此可以发现，通过藻油脂肪酸组
18、成推断的微 藻属名与 18S rDNA 序列分析推断的微藻属名完全 一致，两者的数据起到了很好的补充。不过对于一 般的 DHA 藻油应用企业而言，通过藻油脂肪酸来推 断微藻属名更加便利。如果应用企业需要进一步确 定其藻油来源，可以请藻油生产企业提供藻细胞的18S rDNA 序列分析结果，并通过系统进化树分析确 定具体的微藻属名。3结 论由 S1、S2 和 S3 藻 油脂肪酸组成可以推断这 3 株微藻都是裂壶藻，但无法确定具体的裂壶藻属名。 由这 3 个藻粉得到的 18S rDNA 序列分析，无论是与 Genbank 比对，或通过系统进化树分析，可一致确认 出这 3 个藻粉是裂壶藻，也基本能判断
19、出微藻的属 名。S1 最 接 近 Schizochytrium sp FJU 512，S2 和 S3 最接近 Schizochytrium sp ATCC20888。通过 18S rDNA 序列建立的系统进化树分析确定微藻属名其参考文献:1 COHEN Z，RATLEGDE C Single cell oil M Cham- paign，USA: AOCS Press，2010: 152 常桂芳，王 兴 国 通 过 商 品 化 DHA 藻油的脂肪酸 组 成 推测其微藻属名J 中国油脂，2011，36( 6) : 45 493 李明刚 植物基因操作原理与技术M 天津: 天津科学 技术出版社，20
20、004 TSUI C K，MARSHALL W Labyrinthulomycetes phylogenyand its implications for the evolutionary loss of chloroplastsand gain of ectoplasmic gliding J Mol Phylogenet Evol，2009，50( 1) : 129 1405 黄建 忠，刘 丽 霞，吴 松 刚 高 产 DHA 海 洋 真 菌 Thraus-tochytrium sp FJN 10 脂肪酸的组型及其 18S rDNA 序列分析J药物生物技术，2005，12( 1) : 1 5图 3 基于 S2 微藻 18S rDNA 序列的系统进化树图 4 基于 S3 微藻 18S rDNA 序列系统进化树
