《PCR技术检测结核杆菌的进展.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR技术检测结核杆菌的进展.doc（18页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、PCR技术检测结核杆菌的进展第9卷天津医科大学Vo1.9第4期JTMU2003No.4giotensinsystemandfibrinolyticfunctionJ】.Circulation,1993,87(6):196914】MarreM,BernadetP,GalloisY.eta1.RelationshiDsbetweenangiotensinIconvertingenzymegenepolymorphism.plasmalevels,anddiabeticretinalandrenalcomplicationsJ】.Diabetes.1994.43(3):384【15】BarnasU,
2、SchmidtA.IllievichA.eta1.Evaluationofriskfac-torsforthedevelopmentofnephropathyinpatientswithID-DM:insertion/deletionangiotensinconvertingenzymegenepolymorphism,hypertensionandmetaboliecontrolJJDiabetologia,1997,40(3):32716】OhnoJ,KawazuS,TomonoS.Associationanalysesofthepolymorphismsofangiotensinconv
3、ertingenzymeandangiotensingeneswithdiabeticnephropathyinJapanesenoninsulindependentdiabeticJ】.Metabolism,1996,45(2):21817】MarreM,BouhanickB.BerrutG.eta1.Renalchangesonhy-perglycemiaandangiotensinconvertingenzymeintype1diabetesJ】.Hypertension.1999,33(3):77518】邵咏红,黄英伟,陈劲松,等.血管紧张素转换酶基因多态型与糖尿病及其肾脏合并症发病的
4、关系j】.中华肾脏杂志,1999,15(1):3619】LevinsonO.OrenS,YaginC.Angiotensinconvertingenzyme(ACE)genepolymorphisminfldiabeticcohortanddiabeticnephropathyJ】.Harefuah,1999,136(10):76820】FujisawaT,IkegamiH,KawaguchiY,eta1.Metaanalysisofassociationofinsertion/deletionpolymorphismofan-giotensinIconvertingenzymegenewit
5、hdiabeticnephropathyandretinopathyJJ.Diabetologia,1998,41(1):4721】ParvingHH,JacobsenP.TarnowL.eta1.Effectofdeletionpolymorphismofangiotensinconvertingenzymegeneonpro-gressionofdiabeticnephropathyduringinhibitionofangiotensinconvertingenzyme:observationalfollowupstudyJ】.BU,1996,313(7057):591【22】FaraS
6、,AzzopardiJ.EllardS.eta1.ACEgenepolymorphismasaprognosticindicatorinpatientswithtype2diabetesandas-tablishedrenaldiseaseJ】.DiabetesCare2001,24(12):211523JGohdaT,MakitaY,ShikeT.etaI.AssociationoftheDDgenotpyeanddevelopmentofJapanesetype2diabeticnephropathyJ】.ClinNephrol2001,56(6):47524】ArazM,YilmazN,
7、GungorK,eta1.AnogiotensinconvertingenzymegenepolymorphismandmicrovascularcomplicationsinTurkishtype2diabeticpatientsJ】.DiabetesResClinPract,2001.54(2):9525】YoshidaH,MitaraiT,KawamaraT.eta1.Roleofthedeletionofpolymorphismoftheangiotensinconvertingenzymegeneintheprogressionandtherapeuticresponsiveness
8、ofIgAnephropathyJ】.jClinInvest,1995,96(5):2162f26】KitamuraH,MoriyamaT,IzumiM,eta1.AngiotensinIconvertingenzymeinsertion/deletionpolymorphism:potentialsignificanceinnephrologyJ】.KidneyIntSuppl,1996,55:S101【27】JacobsenP,RossingK,RossingP,eta1.Angiotensinconvert-ingenzymegenepolymorphismandACEinhibitio
9、nindiabeticnephropathyJ】.KidneyInt,1998,53(4):1002(20030107收稿)PCR技术检测结核杆菌的进展杨晶综述,张乃鑫审校(天津医科大学病理学教研室,天津300070)关键词】聚合酶链反应;结核杆菌;进展中图分类号】R52文献标识码】A文章编号】10068147(2003)04056604用聚合酶链反应(polymeraschainreaction,PCR)技术检测结核杆菌的报道国外始见于1989年nI;10多年来,应用分子生物学技术检测结核杆菌的研究工作取得了许多进展,部分已应用于临床,近年来,在一般PCR扩增技术的基础上,开发了若干更加敏感
10、的新方法.1Roche结核分支杆菌PCR实验和基因探针扩增作者简介:杨晶(1974一),女,博士研究生在读,研究方向:淋巴结病理.分支杆菌直接实验1.1Roche结核分支杆菌PCR实验(RocheAmplicorPCR)由瑞士Roche公司开发,以生物素标记位于结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)l6SrRNA基因中高度保守区域的种特异性引物,用来扩增MBTCDNA中的一段584bp大小的序列,然后,将扩增产物与种特异性探针在微孔板中进行杂交.应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定.检材需预先用NACLNaOH处理(防止携带污染物).567AmplicorPCR检测MBTC
11、的敏感性,特异性分别为44%98%,93%100%【231.本方法与培养法的敏感性大致相当,但有例外,在一组痰液检测中,发现AmplicorPCR法的敏感性(34%)低于培养法(37%)H1.1.2基因探针扩增分支杆菌直接实验(GenProbeAmplifiedMycobateriumDirectTest,AMTDT)即转录介导扩增实验,由美国加州GenProbe公司开发,先进行DNA介导的特异性rRNA等温扩增,扩增子用丫啶酯标记,然后作为化学探针进行核酸杂交,通过检测杂交探针的相对化学发光值来进行鉴定.AMTDT的敏感性和特异性分另U达到63.6%83%和93.7%100%【51.1999
12、年又开发了敏感性更高的加强AMTDT(EAMTDT),通常针对高度怀疑或需要排除结核病的病例,其敏感性和特异性可达85.92%88.3%和97.8%-99.1%【71.目前仅此两种方法获得美国FDA认证用于直接检测呼吸系统MBTC,常用于MBTC筛选实验,较单纯PCR更敏感,这可能与有的菌株缺乏IS6110插入序列有关隅】.对于痰涂阳检材,AmplicorPCR和AMTDT的敏感性(分别为98%和100%)显着高于涂阴的检材(分别为39.2%50%和40.5%46%)b一1,这可能与涂阴痰液中结核杆菌过少有关,因此,涂阴痰液的PCR检测应与传统方法(抗酸染色和细菌培养)相结合,并且要结合临床表
13、现做出诊断.上述两种方法检测结果对于结核病患者的诊断和治疗具有重要意义:如果痰涂片阳性,PCR扩增阴性并且未发现抑制物,则提示患者可能并非由结核杆菌而是由其他分支杆菌感染,需要调整治疗方案,因而患者无需隔离,也避免了创伤性检查.对于痰涂阴患者,这两种PCR方法能够确定结核杆菌感染,而且比常规传统方法要快得多,一般只用3.59h【5】,为患者争取了治疗时间.2连接酶链反应(Ligasechainreaction,LCx)1991年由Barany建立.于LCx检测,在PCR反应体系中,含有Taq连接酶,扩增靶序列位于编码蛋白抗原b的基因中(该基因为结核分支杆菌复合群所特有);扩增体系中包含两对引物
14、并作为探针,每对引物分别用捕获半抗原和检测半抗原标iE;PCR扩增过程中,一对探针与DNA一条单链上的蛋白b基因靶序列杂交时,探针之间几个寡核苷酸缝隙在聚合酶作用下填充,然后连接酶能将这对探针形成的扩增片段共价连接形成扩增产物,该产物与原有的靶序列互补,本身也可以作为下一次扩增循环的靶序列.这时的扩增产物一端含有了捕获半抗原,另一端含有检测半抗原.在LCx热循环仪中进行大约37次扩增后,扩增产物在LCx热分析仪上通过微酶联免疫测定法进行检测.LCx检测呼吸道标本的敏感性和特异性分别为75.7%97%和98.8%100%【9引,检测肺外标本的敏感性和特异性分别为53.6%86%和98%100%9
15、-131,均稍高或显着高于培养法.对于痰液涂阳标本检测的敏感性可达100%【11,涂阴标本的敏感性为36.8%71.1%【9m.这提示对于痰涂阴标本的患者,LCx检测如果进行严谨的操作和分析,其结果也具有一定的价值.LCx的特点是:快速而简便,一般经58h可获结果,检测过程为半自动化,扩增系统完全封闭,不存在交叉污染或携带污染,对于呼吸道和非呼吸道标本的检测均有高度敏感性和特异性,对痰液涂阴标本也有一定诊断价值,可对分支杆菌种属进行鉴别u.,涂片阳性而LCx阴性时提示为非结核分支杆菌感染,结核杆菌培养阴性,LCx常可呈阳性,故不适于化疗随访u引,假阳性率和假阴性率较少.3巢式.PCR(Nest
16、PCR,nPCR)在PCR反应体系中具有内,外两对引物,完成两次扩增.内引物位于靶序列两侧,具有菌种特异性;外引物则紧邻内引物而居其外侧,具有分支杆菌属特异性.外引物的退火温度高于内引物,先行PCR扩增,随后,温度降低时,内引物进行扩增.因此,在同一PCR体系中,靶序列得以成倍性扩增,提高了PCR的敏感性,且可进行菌种鉴别.nPCR扩增的靶序列不尽相同,大多为IS6110插入序列u,坫1,有的研究为MPB64,IS986和16SrRNA等u,埔1.nPCR适用于各种标本的检测,敏感性可达70%93.2%,特异性达85%98.6%,181.nPCR较一般PCR敏感,可将同一组标本的敏感性从76.
17、65%提高到93.04%11oI.与AmplicorPCR和AMTDT相比,nPCR的敏感性稍差或相差不多,但是,nPCR对痰液涂阴标本的敏感性则高于AmplicorPCR和AMTDT【1引,关键在于优化反应条件.nPCR的特点是:快速(6h可获结果),价格较ArnplicorPCR,AMTD和LCx便宜,敏感性高,可检出100fgDNAn9,尤其适用于涂阴标本,PCR阴转时间比细菌学滞后,故不适于化疗随访.可进行分支杆菌种属鉴别.4链替代扩增反应(stranddisplacementamplifi.cation,SDA)这是一种等温DNA扩增方法.靶序列DNA加热变性后,引物与其对应DNA单
18、链杂交,在聚合酶作用下,产生具有HincII识别位点的5和3末端的靶DNA序列;HincII限制性核酸内切酶切割该识别位点,依赖DNA聚合酶的作用,在切割处延伸3端,进而替代另一条DNA链;该替代链与引物杂交后又继续扩增,使靶序列呈指数增长;扩增产物与生物素标记的DNA探针杂交,用化学发光酶联免疫实验进行检测.链替代扩增反应对于呼吸系统标本检测的敏感性,特异性,PPV(阳性预测值)和NPV(阴性预测值)分别为100%,99.2%,85.7%和100%;对于涂阳标本,分别为100%,99.4%,93.4%和100%,涂阴标本分别为100%,80.8%,75%,100%f20J.它与Amplico
19、rPCR相比【2,对于培养阳性标本的敏感性分别为94.7%和89.5%,特异性分别为98.3%和100%.链替代扩增反应系统可同时扩增多份标本,整个过程仅需6h.本检测方法虽然敏感性高,但受到靶序列,引物序列,样品处理等多种因素的影响,具有一定的局限性.5Q一复制酶扩增方法(QBetaReplicaseamplifiedAssay)噬菌体QB具有一种RNA聚合酶,本方法通过特异地识别噬菌体QpRNA基因的二级结构进行RNA基因复制,而不需要寡核苷酸引物.MDVRNA是目前应用最广泛的一种小QB复制酶的非病毒模板.将一段作为探针的短序列插入MDVRNA中,并不影响其复制,从而使探针序列得以扩增.
20、QJ3复制酶扩增具有较高的敏感性和特异性,提高了涂阴标本的检出率,降低了假阴性率,并可对标本中的结核分支杆菌进行半定量分析.美国已于1997年推出Qp复制酶扩增仪和配套试剂盒1,使扩增在密闭的条件下进行,简化了操作,减少了污染,每次检测需36.5h,可自动分析10个样品.6探索中的分子生物学检测技术6.1分子信标技术(MolecularBeacon)也称荧光定量PCR技术或实时定量PCR技术,出现于1996年,是一种能够定量的均相荧光PCR技术.在PCR扩增过程中引入了荧光标记的探针,游离单链DNA探针以一种茎一环结构存在.环状结构与靶序列互补,为真正意义探针,茎状结构即探针的两臂由与靶序列无
21、关的互补序列复性构成.两臂末端连有荧光报告基团和卒灭基团,茎环结构使两基团距离靠近,由于荧光素的共振能量转移而使荧光被吸收,从而失去荧光信号.PCR扩增过程中,探针与靶基因完全互补时,经复性可发生杂交,结果使探针5.与3端分开,卒灭作用消失而产生荧光,如果二者不互补,则探针又恢复茎环结构而发生卒灭作用,导致荧光消失.所以可以用荧光定量PCR仪在PCR过程中实时检测荧光强度或在PCR扩增结束后用荧光检测仪检测荧光强度而判定结果.1998年以来,国外渐有应用MBPCR进行结核杆菌检测的报导【2.与常规PCR技术比较,MBPCR的优点是:可定量分析,整个过程在密闭管内进行,可有效防止扩增子的污染,提
22、高结核杆菌检测的特异性,省却PCR后处理过程,提高了样品分析速度,简化操作步骤.6.2DNA指纹技术多用于结核病流行病学调查,主要对MBTC水平的鉴定.目前应用最广泛的是以IS6110插入序列为基础的MBTC鉴定,IS6110序列在MBTC进化中移动性小,不同来源MBTC插人序列IS6110位置和数量不同,特别适于MBTC菌株水平检测,但此技术也存在一些问题,主要是有的MBTC缺失IS6110序列或只有单拷贝,或一些地区MBTC指纹图谱差异小,难以对菌株水平鉴定.有学者提出应用短串联重复序列,间隔区DNA或其他插入序列如IS1081等为基础进行鉴定,总之这项技术还需进一步研究.另外还有限制性片
23、段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术,也用于流行病学调查1.有报道通过对hsp65基因片段的分析,可以鉴别34种分支杆菌种类和亚种J.7结语总之,PCR技术引用到结核杆菌感染的诊断中来,提高了诊断效率,节省了时间,但是也存在它的一些弊端,有时会产生一些假阳性和假阴性结果.影响结核杆菌DNAPCR检测的主要因素有:(1)引物,应用单一性引物和联合应用两套引物的敏感性和特异性不同.(2)检材,最常用的检材为569痰液,支气管灌洗液和胸水等,其次为来自肺外结核病较常见的器官(淋巴结,脑等),包括体液和石蜡包埋组织.少见检材有心包积液
24、,耳瘘分泌物,肾上腺,腮腺等.造成假阳性的原因可能是:(1)PCR较传统方法敏感,易被污染,(2)引物特异性低,(3)电泳结果误判(片段大小相似所致).为了避免假阳性结果,要求实验室必须布局合理,并采取严格操作规程,重复使用物品器具必须每天用消毒液浸泡过夜等措施.假阴性结果的主要原因可能是:(1)扩增反应敏感性低,标本中细菌含量少或细菌扩散不均一,(2)标本中存在聚合酶抑制物,(3)扩增和培养所用标本体积差异巨大,(4)结核杆菌细胞生长丛集性,(5)菌株发生基因突变,缺乏所扩增的基因片段,(6)抽提DNA时,细菌未破壁,(7)操作方法不当,技术不过关,实验器材不合格或试剂失效等.参考文献:【1
25、】HanceAJ,GrandchampB,LevyFrebauhV,eta1.Detectionandidentificationofmycobacteriabyamplificationofmy-cobacteriaDNAJ】.MolMicrobiol,1989,3:8432】GomezPastranaD,TorronterasR,CaroP,eta1.Comparisonofamplicor,inhousepolymerasechainreaction,andcon-ventionalcultureforthediagnosisoftuberculosisinchildrenJ】.Clin
26、InfectDis,3.2001,32(1):173】LebrunL,MathieuD,SaulnierC,eta1.LimitsofcommercialmoleculartestsfordiagnosisofpulmonarytuberculosisJ】.EurRespirJ,1997,10(8):18744】JatanaSK,NairMN,LahiriKK,eta1.Polymerasechainreac-tioninthediagnosisoftuberculosisJ】.IndianPediatr,2000,37(4):3755】GamboaF,FernandezG,PadillaE,
27、eta1.Comparativeevalua-tionofinitialandnewversionsoftheGenProbeAmplifiedMvcobacteriumTuberculosisDirectTestfordirectdetectionofMycobacteriumtuberculosisinrespiratoryandnonrespiratoryspecimensJ】.JClinMicrobiol,1998,36(3):6846】BemerMelchiorP,GermaudP,DrugeonHB.Diagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyac
28、ommercialpolymerasechainreactionkitJ】.PatholBiol,1998,46(8):5977】BergmannJS,YuohG,FishG,eta1.ClinicalevaluationoftheenhancedGenProbeAmplifiedMycobacteriumTuberculosisDirectTestforrapiddiagnosisoftuberculosisinprisoninmatesJ】.JClinMicrobiol,1999,37(5):14198】SeThoeSY,TayL,SngEH.EvaluationofAmplicorand
29、IS6110一PCRfordirectdetectionofMycobacteriumtubercu-losiscomplexinSingaporeJ】.TropMedIntHealth,1997,2(11):109591BrownTJ.PowerEG,FrenchGL.Evaluationofthreetom-mercia1detectionsystemsforMycobacteriumtuberculosiswhereclinica1diagnosisisdifficultJ】.JClinPathol,1999,52(3):193(10JYuenKY,YamWC,WongLP,eta1.C
30、omparison6ftwoauto-matedDNAamplificationsystemswithamanualone_tubenestedPCRassayfordiagnosisofpulmonarytuberculosis【JJ?11】12】JClinMicrobiol,1997,35(6):1385PiersimoniC,CallegaroA,ScarparoC,eta1.Comparativee-valuationofthenewgenprobeMycobacteriumtuberculosisamplifieddirecttestandthesemiautomatedabbott
31、LCxMy-cobacteriumtuberculosisassayfordirectdetectionofMy.cobacteriumtuberculosiscomplexinrespiratoryandextrapulmonaryspecimensJ】.JClinMicrobio1.1999.37(4):1236RantakokkoJalavaK,MarjamakiM,MarttilaH,eta1.LCxMycobacteriumtuberculosisassayisvaluablewithrespiratoryspecimens,butprovidesIittlehelpinthedia
32、gnosisofextra-pulmonarytuberculosisJ】.AnnMed,2o01,33(1):5513】GamboaF,DominguezJ,PadillaE,eta1.RapiddiagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyligasechainreactionamplificationJ】.JClinMicrobiol,1998.36(5):132414】AlonsoP,OrdunaA,BratosMA,eta1.Clinicalevaluationofacommercialligasebasedgeneamplificationmetho
33、dforde-tectionofMycobacteriumtuberculosisJ】.EurJClinMicrobiolInfectDis.1998,17(6):37115】GamboaF,DominguezJ,PadillaE,eta1.RapiddiagnosisofextrapulmonarytuberculosisbyligasechainreactionamplificationJ】.JClinMicrobiol,1998,36(5):132416】GomezPastranaD,TorronterasR,CaroP,eta1.Diagnosisoftuberculosisinchi
34、ldrenusingapolymerasechainreactionJ】.PediatrPulmonol.1999,28(5):344171SkotnikovaOI,s0bolevAY,DemkinVV,eta1.ApplicationofnestedPCRtechniqueforthediagnosisoftuberculosisJ】.BullExpBiolMed.2000,129(6):61218】MoussaOM,ErakyI,ElFarMA,eta1.Rapiddiagnosisofgenitourinarytuberculosisbypolymerasechainreactionan
35、dnonradioactiveDNAhybridizationJ】.JUrol,2000,164(2):584191KambashiB,MbuloG,McNerneyR,eta1.UtilityofnucleicacidamplificationtechniquesforthediagnosisofpulmonarytuberculosisinsubSaharanAfricaJ】.IntJTubereLungDis,2001,5(4):364201KambashiB,MbuloG,McNerneyR.Utilityofnucleicacidamplificationtechniquesfort
36、hediagnosisofpulmonarytuber-culosisinsubSaharanAfricaJ】.IntJTubercLungDis,21】22】23】24】25】2o01,5(4):364Chi5ramaIS.ItoY.SugiuraF,etaI.DiagnosticvalueofthestranddisplacementamplificationmethodcomparedtothoseofRocheAmplicorPCRandculturefordetectingmycobacteriainspurumsamplesJ】.JClinMicrobiol,1997,33:332
37、SimithJH.RadcliffeG,RigbyS,etaI.Performanceofanau-tomatedQBetareplicaseamplificationassayforMycobac-teriumtrbercu1osisinaclinicaltrialJ】.JClinMicrobiol,1997,35:1484PiatekAS.TyagiS,PoIAC,etaI.MolecularbeaconsequenceanalysisfordetectingdrugresistanceinMycobacteriumtuber-culosisJ】.NatBiotechnol,1998,26
38、.16(4):359GarciaMR,RodriguezJC,NavarroJF,eta1.MolecularepidemiolQgyoftuberculosisinElche,Spain:a7一yearstudyJ】?JMedMicrobio1.2002,51(3):273DewalloisA.GohKS,RastogiN.Rapididentificationofmy-cobacteriatospecieslevelbyPCRrestrictionfragmentlengthpollmorphismanalysisofthehsp65geneandpropostttonofanalgorithmtodifferentiate34mycobacterialspeciesJ】.JClinMicrobio1.1997,35:2969(20030107收稿)
