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1、体外培养人外周血白细胞中阿德福韦酯诱生干扰素的作用研究430ChinJCliniHepatol.December2o07.Vo1.23.No.6体外培养人外周血白细胞中阿德福韦酯诱生干扰素的作用研究江军,缪晓辉,蔡雄,王雯婧(1.解放军第113医院感染科,浙江宁波315040;2.长征医院感染科,上海200003)【摘要】目的观察阿德福韦酯对慢性乙型肝炎(CHB)患者和健康人体外培养的外周血白细胞(WBC)作用后,培养上清中干扰素活性的动态变化,探讨阿德福韦酯是否能诱导WBC产生干扰素.方法抽取20名CHB患者和20名健康人的外周血,将白细胞放人有不同浓度阿德福韦酯(5g/ml,7.5g/ml
2、,lOng/ml及无药对照组)的培养液中,分别于24,48及72小时三个时间点利用微量细胞病变抑制法(CPE)测定培养液中IFN的效价.结果健康人组中,24小时点三组均高于无药对照组(P<0.001),其中5g/ml组72小时点与24小时点比有明显升高(P=0.004);CHB患者组中,各时间点不同浓度阿德福韦酯组与对照组无差异.结论阿德福韦酯有一定诱生正常人WBC分泌干扰素的作用,而对CHB患者的WBC则此作用不明显.【关键词】阿德福韦酯;病毒性肝炎,乙型,慢性;外周血白细胞;干扰素【中图分类号】R978.7【文献标识码】B【文章编号】10015256(2007)06043003Eff
3、ectsofadefovirdipivoxilonthesecretionofinterferon(IFN)inculturingwhitebloodcellsJIANGJun,MIAOXiaohui,CAIXiong,eta1.(DepartmentofInfectiousDisease,113thHospitalofPLA,Ningbo,315040)Abstract:ObjectiveToobservewhetheradefovirdipivoxilhasantiviralimmunologicaleffectinvitroculturingwhitebloodcellsofpatien
4、tstllchronichepatitisB(CHB)andnormalpeoplebydeterminingtheIFNactivityinculturemedium.MethodsThebloodspecimenweregatheredfromtwentyCHBpatientsandtwentyhealthpeople,thenWBCwereculturedinmediumcontainingadefovirdipivoxil(5ug/ml,7.5ug/mlandlOug/m1)andcontrolgroupwithnoadefovirdipivoxil.Atdifferenttime(2
5、4h,48h,72h)afteragentadded.culturemediumwereharvested.Meanwhile,IFNactivityofeachsamplewasdeterminedbycytopathiceffectinhibitionassay.ResultsAtdifferenttimeafterdrugswereadded,inhealthpeople,thetitersofIFNactivityindruggroups(5ug/ml,7.5ug/mlandlOug/m1)improvedsignificantlyat24h(P<0.001),in5ug/mlg
6、roupitWassignificantlyhigherat72hhoursthanthatat24h(P=0.004);therewerenosignificantdifferencebetweendruggroupsandcontrolgroupsinCHBpatients.ConclusionAdefovirdipivoxilcaninduceWBCofhealthypeopletosecreteinterferontocertainextent,butthisfunctionisntsignificantinWBCofpatientswithCHB.Keywords:adefovird
7、ipivoxil;chronichepatitisB;whitebloodcells;IFN阿德福韦酯是一种无环单磷酸脱氧腺苷类似物,通过竞争性结合多聚酶的结合位点与竞争性掺人病毒DNA链,使病毒复制受到抑制.在临床试验中发现,阿德福韦可能还有免疫调理作用J.为了证实和探索上述现象的机制,本研究以体外培养的CHB患者和正常人外周血WBC为研究对象,经阿德福韦酯作用后,在不同时间点检测培养上清中干扰素活性的动态变化,观察阿德福韦酯是否能诱导WBC产生干扰素,探讨可能的免疫效应机制.1材料和方法1.1研究对象2O名均为我科住院的CHB患者,男性l4例,女性6例,半年内未进行过抗病毒治疗,收稿日期:
8、20061206修订日期:2007一Oll1作者简介:江军(1972一),男,主治医师,硕士,研究方向:病毒性肝炎的治疗及免疫机制.通讯作者:缪晓辉,Email:xhuiao年龄(2345)岁.诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案,排除其他HAV,HCV,HDV,HEV的重叠感染及肝硬化患者.2O名正常人为我科工作人员的全血,男性16例,女性4例,年龄(2650)岁.各项肝炎病毒标志物均为阴性,肝功能正常.1.2标本的获取及处理无菌条件下对2O名CHB患者和2O名正常人各采静脉全血10ml,EDTA2001xg抗凝,加入植物血凝素(PHA,1001xg),加入10mlRPMI1640培养液,
9、按加入ADV剂量:(Og/ml,5g/ml,7.5g/ml,101xg/m1)平均分为四组,放人10ml离心管中;在37水浴箱中孵育24h,48h,72h,各个时间点分别取上清2001xl,一2O冰箱保存,待集中标本后,用微量细胞病变抑制测定法(CPE)统一检测IFN的效价.1.3主要材料和仪器细胞培养试剂:小牛血清,RPMI1640培养液购自GIBCO公司;植物血凝素PHA,DMEM培养基购自华美生物工程公司;人羊膜临床肝胆病杂志2007年第23卷第6期细胞(WISH细胞),水疱性口炎病毒(VSV),第二军医大学微生物教研室馈赠,WISH细胞由本实验室冻存,自行传代培养.主要实验仪器:CO恒
10、温孵箱(Heraeus),倒置显微镜,CSD一2超净工作台(上海净化设备厂产品),113型和215型高速离心机(Sigma),荧光酶标仪(BioTech).1.4研究方法1.4.1WISH细胞培养从液氮罐中取出冻存的WISH细胞,解冻细胞成悬液,800r/min离心5min,弃上清,并重复洗涤一次.将洗涤后的WISH细胞用15%小牛血清培养液稀释,接种于培养瓶中,置于37,含5%CO,的孵箱中培养.根据细胞生长情况每23天换液一次,56天传代一次.1.4.2VSV病毒的增殖和滴定将预先培养好的WISH细胞单层用10%胰酶消化下来,制成6010个/ml悬液,向48孔培养板每孔快速加入1001xl
11、细胞悬液,置CO培养箱中培养2小时.向培养板每孔加入1001xlVSV病毒液,加样顺序是从高到低5倍稀释,孵箱中培养24小时.用微量细胞病变抑制431测定法(CPE)检测VSV病毒的效价.1.4.3微量细胞病变抑制测定法按常规方法将WISH细胞制成6010爪/ml悬液,每孔加入501xl细胞悬液;待测标本进行1:2梯度稀释为8个浓度;向96孔培养板,从高稀释度到低稀释每孔加入501xl处理后的血清样品,细胞对照孔和病毒对照孔内加50ill营养培基;置CO培养箱中培养24小时;将各孔内液体倒掉,除细胞对照孔加1001营养培基外每孔中加入1001xl病毒(VSV,200TCID50/m1).置37
12、孵育,直到病毒对照孔的CPE达+为止.弃病毒液,将整块板泡人结晶紫染液中,染色15分钟以上.向每孔中加入2001脱色液脱色,置特制酶联比色计中在540nm波长处比色.1.5统计学处理采用SPSS11.0软件,多个样本均数比较用方差分析后,采用配对样本t检验法.2结果患者组中,各时间点不同剂量阿德福韦酯组之间,干扰素的效价无差异,详见表1.表1阿德福韦酯对患者和健康人外周血白细胞作用后干扰素效价的变化(xs)注:与未加阿德福韦酯组比,24小时点5g/ml,7.5g/ml,10/ml组,3.4063.564,P<0.1301;#5g/ml组72小时点与24小时点比,3.237,P=0.004
13、;均具有统计学差异.3讨论HBV是一种嗜肝病毒,但对HBV能否感染肝外组织则有较大的争议.有许多文献报道在一些肝外组织如肾脏,胰腺,肺,心肌,心包膜,皮肤,胃肠道粘膜,睾丸,前列腺,皮肤,PBMC等组织中均检测到HBsAg,HBeAg等病毒抗原和HBVDNA,因而认为HBV不仅能侵犯肝脏,而且能侵犯几乎全身各个组织,具有泛嗜性J.PBMC由于与机体的免疫功能关系密切,因而关于PBMC中HBV感染情况的研究尤其活跃.有研究认为HBV可以在PBMC中复制并产生有感染性的子代病毒,削弱B细胞,CD4T细胞,NK细胞等免疫细胞的防御功能,成为慢性肝炎发病原因之一.本研究发现:CHB患者组中,三个时间点
14、不同量阿德福韦酯组与未加阿德福韦酯比干扰素效价无统计差异;正常人组中,24小时点阿德福韦酯组5g/ml,7.5g/ml,lOng/ml组与对照组干扰素效价有明显差异,72小时点阿德福韦酯组5g/ml和对照组明显高于24小时点;但7.5g/ml,lOng/ml两组在48,72小时低于24小时点,考虑是随着作用时间的延长,7.51xg/ml,lOng/ml组的药物浓度对正常白细胞造成损害.以上结果提示阿德福韦酯对CHB患者WBC没有干扰素诱生作用;对正常人WBC有一定的干扰素诱生作用,分泌干扰素的能力明显强于患者组.可能的机制:慢性肝病患者血清中存在诱生IFN的抑制因子,肝病时出现的有害物质.;影
15、响阿德福韦酯对WBC诱生IFN的能力;Mokoto等研究认为乙肝病毒基因可能主要是以整合形式存在于外周血单个核细胞(PBMC)中的,可能是PBMC中的HBV感染影响阿德福韦酯对患者PBMC诱生IFN的能力;PBMC是外周血WBC的主要成分.本研究发现阿德福韦酯有一定的诱生正常人WBC分泌干扰素的作用,而对CHB患者的此作用不明显.阿德福韦酯具体通过何种途径来调理正常人WBC分泌干扰素,而CHB患者外周血WBC中为432何未显示该现象,确切的机制有待进一步研究.参考文献l1CalioR,VillaniN,BalestraE.eta1.Enhancementofnaturalkilleractiv
16、ityandinterferoninductionbydifferentacyclicnucleosidephosphonatesJ.AntivirRes,1994,23:7789.2CooksleyH,ChokshiS,WedemeyerH,eta1.HepatitisBvirusspecificT?cellreactivityduringadefovirdipivoxiltreatment:amulticenter,controlledstudyJ.JHepatol,2002,36(Suppl1):68.3殷宁铬,杜孝元,王洪海.慢性活动性肝炎,肝硬化患者肝外组织中HBVDNA和HBV抗原
17、的检测J.中华消化杂志,1990,ChinJCliniHepatol,December2007,Vo1.23,No.610:7274.4DejeanA,LuggasayC,ZafzaniS,eta1.DetectionofhepatitisBviFusDNAinpancreas,kidneyandskinoftwohumancarriersofthevirusJ.JGenViral,1984,65:651655.5YinXM,DingWX.DeathreceptoractivationinducedhepatocyteapoptosisandliverinjuryJ.CurrMolMed,20
18、03,3:491508.6UmedaM,MarusawaH,SenoH,eta1.HepatitisBvirusinfectioninlymphatictissuesininactivehepatitisBcarriersJ.JHepatol,2005,42:80612.7骆抗先.乙型肝炎基础和临床M.第二版.北京:人民卫生出版社,2003:146.实时荧光定量PCR分析慢性丙型肝炎患者胸腺近期输出功能郭海燕,陈明,汪莉萍,葛国洪,张言超(徐州医学院附属医院感染病科,江苏徐州221002)【摘要】目的观察慢性丙型肝炎(CHC)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除环(TRECs
19、)的含量,从而推测CHC患者的胸腺近期输出功能,并且比较TRECs含量与HCV载量的关系.方法利用实时荧光定量PCR方法检测22例CHC患者及l6例正常人PBMCs中TRECs含量,用RTPCR方法结合荧光探针的检测技术检测CHC组外周血血清中的HCVRNA.结果CHC患者中TRECs含量为(5.521.87)copies/10PBMCs,低于正常人TRECs水平(7.192.42)copies/10PBMCs,P<0.05;TRECs含量与HCV载量直线相关分析r=一0.427,P<0.05.结论CHC患者TRECs水平低于正常人,显示其胸腺近期输出功能明显降低,且与HCV载量呈
20、负相关性.【关键词】慢性丙型肝炎;TRECs;胸腺近期输出功能;实时荧光定量PCR【中图分类号】R512.63【文献标识码】B【文章编号】10015256(2007)06043202RecentthymicoutputfunctioninpatientswithchronichepatitisCbyrealtimefluorescencequantitativePCRanal-ysisGUOHaiyan,CHENMing,WANGLiping,eta1.(DepartmentofinfectionsDiseases,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalColleg
21、e.JiangsuXllzhou221002)Abstract:ObjectiveToanalyzethecontentofTcellreceptorexcisioncircles(TRECs)withinperipheralbloodmononuclearcellsofchronichepatitisC(CHC)patientstovaluethethymicoutputfunctionofCHCandinvestigatetherelationofthymicoutputfunctionandHCVRNAinchronichepatitisC(CHC)patients.MethodsQua
22、ntitativedetectionofTREcsinDNAofperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)from22caseswithCHC,16normalindividualswasperformedbyrealtimefluorescencequantitativePCR.anddetectionofHCVRNAofperipheralbloodseruminCHCbyRTPCRwithfluorescentprobetechnology.ResultsThemeanofTRECsinpatientswithCHC(5.521.87copies/10P
23、BMCs)waslowerthanthatinnormalindividuals(7.19_4-2.42copies/10PBMCs,P<0.05);ThevalueofTRECsinpatientswithCHCwasinverselycorrelatedwithHCVRNA(:-0.427,P<0.05).ConclusionTRECslevelsinCHCarelowerinthehealthyandinverselycorrelatedwithHCVRNA.Keywords:chronichepatitisC(CHC);TCRrearrangementexcisioncir
24、cle(TRECs);recentthymicoutputfunction;realtimefluorescencequantitativePCR丙型肝炎慢性化一直是一个世界性的健康难题,据世界卫生组织最近的一项专题报告指出,自收稿日期:20070109修订日期:20070l一29基金项目:江苏省科委社会发展计划基金(BS2004014)作者简介:郭海燕(1980一),女,江苏连云港人,在读硕士.通讯作者:陈明,Email:chenming715163.corn1989年医学界发现丙型肝炎病毒以来,全球已有1.7亿人受到感染,发病率为3.1%.而在中国,丙型肝炎的发病率为3.2%,也就是说全国约有34千万人是丙肝患者.有报告指出,超过80%的丙肝感染者将发展成慢性肝炎,而丙型肝炎最终又将发展成肝硬化,肝癌.丙型肝炎的危害如此之大,也使得丙型肝炎的治疗研究更为重要,本研究为其合理
