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1、1 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 目录 饲养细胞培养流程图 2 干细胞培养流程图 3-4 细胞室无菌操作 5 原代饲养细胞分离 6-7 饲养细胞传代 8 饲养细胞的丝裂霉素C处理 9 饲养细胞冻存 10 饲养细胞复苏 11 胚胎干细胞复苏100MM 12 阳性克隆复苏96孔板 13 胚胎干细胞传代100MM 14 胚胎干细胞传代96孔板 15 胚胎干细胞传代6孔板 16 胚胎干细胞转染 17-18 挑克隆 19-20 胚胎干细胞冻存100MM 21 胚胎干细胞冻存96孔板 22 胚胎干细胞冻存6孔板 23 96孔板提取DNA 24 附录1干细胞培养中的常用试剂 25 附录2常用试剂
2、的分装和保存 26 附录3常用培养基 27 附录4细胞培养试剂用量明细及细胞计数 28 附录5平皿、平板、冻存管书写规则 29-32 附录6实验记录 33-34 2 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 干细胞实验室课题流程图 饲养细胞feeder cell培养流程图 第16天 收获并冻存MMC MEF-3 第10天 MEF-1到MEF-2的传代1皿分4皿 第1天 解剖孕13.5天小鼠制备原代饲养细胞MEF-0 第5 - 7天 收获并冻存原代饲养细胞MEF-0 第8天 解冻MEF-0恢复培养1-2天 第15天 MMC处理MEF-3恢复培养1天 第12天 MEF-2 到MEF-3的传代4皿分
3、16皿 3 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 干细胞embryonic stem cell培养流程图 第16 - 18天 96孔板挑克隆4板 第7天 收获ESCs并计数随后进行细胞转染恢复培养一天 第8 - 15天 G418筛选转染后的ESCs 第1天 复苏ESCs 第5天 第二次ESCs传代6皿 第3天 第一次ESCs传代2皿 4 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 干细胞embryonic stem cell培养流程图 第1天 阳性克隆复苏 第4天 48孔板到6孔板传代 5 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 第7天 6孔板传代一孔分三孔 第9天 阳性克隆的冻存两孔 第
4、11 - 12天 阳性克隆的复筛 阳性克隆显微注射4个 6 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 细胞室无菌操作 1. 进入细胞室时需检查风机是否正常开启。 2. 进入缓冲间前需穿好白大褂、戴好鞋套衣袖需翻折到肘部以上。 3. 进入缓冲间后需戴好口罩、帽子及手套。 4. 进入无菌室操作之前需用70酒精对双手进行消毒。 5. 实验开始之前生物安全柜需紫外照射至少30分钟用70酒精擦拭操作台、挡风玻璃及金属边框后方可进行实验。 6. 开始实验前需检查生物安全柜风机是否达到指定风量至少3档。 7. 放置于生物安全柜的物品都需用70酒精喷撒消毒。 8. 在生物安全柜中拆包的平皿需将开口翻折封口后方
5、可拿出。 9. 巴氏吸管在使用前需在酒精灯火焰上反复过火。 10.在生物安全柜内打开的各种瓶盖及皿盖摆放时需盖口朝下放置。 11.双手不得在开盖的平皿、瓶口、管口等上方经过以免细菌落入。 12.使用加样槽加液时需用移液管逐次加入不得用瓶直接倾倒。 13.不得将无菌的培养基及培养的细胞在生物安全柜以外打开。 14.观察细胞前需用70酒精擦拭显微镜操作台。 15.将培养的细胞放置于孵箱前需用70酒精喷撒皿底进行消毒。 16.结束实验后用70酒精擦拭操作台、挡风玻璃及金属边框。 注意食物、植物及任何适合微生物生长的物品禁止带入实验室。 7 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 开启全屋紫外消毒前
6、需关闭风机。 原代饲养细胞MEFs分离 实验前的准备 1手术器械灭菌小号弯嘴镊x2小号直镊x2精细镊x1眼科剪x2 2小鼠解剖台及固定针头若干 3取出EF培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 1. 脱颈处死孕13.5天小鼠取出胚胎用PBS清洗后放置到含10ml PBS的平皿中。 2. 分离胎膜胎盘剪去头部、解剖镜下去除内脏组织用PBS尽可能洗尽血液。 3. 收集处理后的胚胎用手术剪尽可能剪碎置碎块到50ml离心管中。 4. 按每个胚胎加入1.52ml 0.05胰酶37水浴消化30min每隔5分钟摇晃一次离心管。 5. 在离心管中加入两倍体积的新鲜EF培养基中和胰酶吹打混匀如遇培养基特别粘
7、稠可用100目无菌细胞筛过滤。注意用细胞筛过滤细胞损失量会加大 6. 1000rpm4离心5min。 8 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 7. 小心吸走上清用手轻轻拍散细胞加入EF培养基吹打混匀后均分至150mm平皿中。按每胚胎铺一个皿每皿25ml细胞悬液 8.“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。 9. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养。 10.将小鼠尸体、组织块用封口袋包裹后置-80保存不得随意丢弃。 11.两天更换一次EF培养基。 9 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 饲养细胞传代 实验前的准备 1取出EF培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 注意150m
8、m平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走MEF-0内的EF培养基。 2. 在150mm平皿中沿壁加入10ml PBS清洗2次轻轻摇晃后吸出。 3. 取3.5ml/皿 0.05 胰酶加入平皿中铺匀后置37孵育箱消化3 min。注意在显微镜下快速观察是否消化彻底 4. 在平皿中加入6.5ml/皿 EF 培养基终止消化轻轻吹打细胞4-6次/皿并轻轻沿壁冲洗平皿1-2次。 5. 将细胞悬浮液加入50ml离心管。 6. 1000rpm、4离心5min。 7. 小心吸走上清用手轻轻拍散细胞在离心管中加入EF 培养基吹打混匀后沿壁加入4个150mm平皿。每皿25ml细胞悬液 8.“8”字水平轻摇平皿使细胞
9、均匀分布于皿底上。 10 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 9. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养。 饲养细胞的丝裂霉素CMMC处理 实验前的准备 1制备MMC10mg母液: 将9.5ml PBS和0.5ml DMSO混匀后加入MMC瓶中将混合液加入5ml无菌注射器中经0.22um过滤器过滤到15ml离心管中 用锡纸包裹离心管标记后4避光保存。注意母液配置后需在1个月内用完 2取出EF培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 注意150mm平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走MEF-3内的EF培养基。 2. 每个150mm平皿沿壁加入15ml MMC工作液。注意MMC母液用培养
10、基稀释100倍即为工作液工作液需现用现配 3. 37C5 CO2孵育箱培养4小时。 4. 吸走平皿内的MMC工作液。 11 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 5. 每皿沿壁轻轻加入10ml PBS洗涤后吸出清洗两遍。 6. 每个150mm平皿沿壁加入20ml EF培养基。 7. 37C、5 CO2孵育箱恢复培养1天。 注意MMC处理后的饲养细胞在收获时需取1x106试铺一个100mm平皿每天观察是否继续生长及是否有污染连续观察2天。 饲养细胞冻存 实验前的准备 1制备冻存液 FBSDMSO 91用锡纸包裹离心管标记后4避光备用。 注意冻存液常温具有细胞毒性且不稳定需现用现配 2标记冻存
11、管 3取出EF培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 注意150mm平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走150mm平皿内的EF培养基。 2. 在150mm平皿中沿壁加入10ml PBS清洗2次轻轻摇晃后吸出。 3. 每皿加入3.5ml 0.05胰酶 铺均至平皿后37孵育箱消化3min。 12 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 4. 每皿加入6.5ml EF培养基终止消化吹打混匀后加入50ml 离心管中。注意吹打次数严格控制在6次以内不得过度吹打细胞 5. 计数细胞。台盼蓝40ul细胞悬液20ul稀释倍数3倍 6. 1000rpm、4离心5min。 7. 吸走上清用手轻轻拍散细胞
12、加入适量冻存液混匀后加入标 记好的冻存管中。每管1ml冻存液冻存规格为1x107和3x106 8. 将冻存管封口膜包裹后置泡沫盒-80C 过夜次日转液氮冻存。 饲养细胞复苏 已经过MMC处理 实验前的准备 1取出EF培养基常温备用 2准备防爆面罩及防冻手套 3提前30 min用0.1明胶对需要铺板的平皿、平板做预处理 1. 在50ml离心管中加入10ml EF培养基。 2. 戴上防爆面罩及防冻手套后迅速将含有MMC饲养细胞的冻存管从液氮中取出放入37水浴锅的冻存架中迅速扣上水浴锅盖计时2min如液氮罐至水浴锅的距离较远则需将冻存管放入泡沫盒内转移2min后打开水浴锅盖用手握住冻存管盖在水 13
13、 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 浴锅中迅速摇晃融化直至含少许冰晶。注意不得将冰晶全部化完在水浴锅中的时间控制在3min内 3. 70酒精喷撒冻存管后将冻存管中的悬液用1000ul单道枪移至离心管中取少许离心管内的EF培养基涮洗一下冻存管将离心管拧紧后轻轻颠倒数次混匀一次最多同时解冻3管 4. 1000rpm4离心5min。 5. 吸走上清拍散后沿壁加入适量EF培养基重悬后铺于若干100mm平皿中。注意每皿10ml细胞悬液根据品系1x107的细胞量最多可铺6个100mm平皿、3x106的细胞量最多可铺2个100mm平皿 6.“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。 7. 标记后3
14、7C、5CO2孵育箱培养。 胚胎干细胞复苏100mm 实验前的准备 1取出ES培养基常温备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的100mm平皿观察有无污染 1. 在15ml离心管中加入10ml ES培养基。 2. 戴上防爆面罩及防冻手套后迅速将含有干细胞的冻存管从液氮中取出放入37水浴锅的冻存架中迅速扣上水浴锅盖计时 14 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 2min如液氮罐至水浴锅的距离较远则需将冻存管放入泡沫盒内转移2min后打开水浴锅盖用手握住冻存管盖在水浴锅中迅速摇晃融化直至含少许冰晶。注意不得将冰晶全部化完在水浴锅中的时间控制在3min内 3. 70酒精喷洒后将冻存管中的悬液用
15、1000ul单道枪移至离心管中取少许离心管内的ES培养基涮洗一下冻存管将离心管拧紧后轻轻颠倒数次混匀。一次最多同时解冻3管 4. 1200rpm4离心5min。 5. 吸走上清拍散细胞后沿壁加入10ml ES培养基重悬后铺于一个含MMC饲养细胞的100mm平皿中。注意每皿10ml细胞悬液1x106的细胞量可铺1个100mm平皿 6.“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。 7. 标记后37C、5CO2孵育箱培养。 阳性克隆复苏96孔板 实验前的准备 1取出G418培养基常温备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的48孔板观察有无污染 1.从-80冰箱取出96孔板阳性克隆用保鲜膜封扎后迅速在
16、37水浴锅中水浴2-3min。注意96孔板外围部分孔的冰晶快要化完 15 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 时需立即将96孔板从水浴锅中拿出 2.在需要复苏的孔中加入100ul/孔 G418培养基待冰晶融化后随即转至含MMC饲养细胞、200ul/孔 G418培养基的48孔板的孔中。 3.标记后37C、5CO2孵育箱培养。 注意由于冻存液中含有DMSO复苏的阳性克隆需于第二天早上更换新鲜G418培养基。尽量选择下午复苏 胚胎干细胞传代100mm 实验前的准备 1取出ES培养基、PBS常温备用0.25胰酶冰浴备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的100mm平皿观察有无污染 1. 吸走10
17、0mm平皿的ES培养基。注意传代前1h需更换新鲜 16 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 ES培养基 2. 每皿沿壁加入5ml PBS轻轻摇魏笪銮逑戳奖椤?3. 每皿沿壁加入1.5ml 0.25胰酶铺匀后置37孵育箱消化3min。 4. 每皿沿壁加入3.5ml ES培养基终止消化充分吹打使大部分细胞都处于单个悬浮状态注意吹打次数约15次/皿如遇吹打不散的情况请检查吹打力度及胰酶活性。 5. 将细胞悬浮液加入50ml离心管轻轻吹打混匀。 6. 计数细胞。台盼蓝40ul细胞悬液20ul稀释倍数3倍 7. 1200rpm、4离心5min。 8. 吸走上清用手轻轻拍散细胞在离心管中沿壁加入适量
18、ES培养基吹打混匀后沿壁注入若干含MMC饲养细胞的100mm平皿。注意每皿10ml细胞悬液。需两天后传代每皿细胞数需控制在6x105内 9.“8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。 10. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养。 胚胎干细胞传代96孔板 实验前的准备 1取出ES培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的96孔板观察有无污染 3准备含70乙醇的加样槽过火前蘸一下建议去除此步骤 17 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 1. 吸走96孔板的培养基。8道吸头过火几次后 2. 每板加入100ul/孔 PBS轻摇后吸出清洗两遍。 3. 每板加入
19、50ul/孔0.25胰酶铺匀后置37孵育箱消化3min。 4. 每板加入100ul/孔G418培养基终止消化吹打混匀。注意吹打次数控制在20次左右且排枪量程不得超过150ul120ul量程吹打否则会出现过多泡沫 5. 根据需要将细胞悬液均分至若干含MMC饲养细胞的96孔板中。注意转至新铺96孔板时每板细胞悬液最终为200ul/孔 6. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养。 胚胎干细胞传代6孔板 实验前的准备 1取出ES培养基、PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的6孔板观察有无污染 18 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 1. 吸走6孔板的ES培养基。
20、2. 每板沿壁加入1ml/孔 PBS轻摇后吸出清洗两遍。 3. 每板沿壁加入0.4ml/孔0.05胰酶铺匀后置37孵育箱消化3min。 4. 每板沿壁加入0.8ml/孔ES培养基终止消化吹打混匀。注意用1000ul单道枪吹打次数控制在8次内量程选择1000ul 5. 根据需要将细胞悬液均分至若干含MMC饲养细胞的6孔板中。注意转至新铺6孔板时每板细胞悬液最终为2ml/孔 6. 采用前后左右轻拍的方式将细胞悬液拍匀。 7. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养。 胚胎干细胞转染 实验前的准备 1取出ES培养基常温备用PBS、0.25胰酶、电击杯冰浴备用 19 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公
21、司 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的100mm平皿观察有无污染 3线性化DNA不少于30ug不多于75ug-20冻一晚上除菌 4电转仪预热30min 1. 吸走100mm平皿的ES培养基。注意电转1小时前需更换新鲜ES培养基 2. 每皿沿壁加入5ml PBS侧壁加PBS轻轻摇晃后吸出清洗两遍。 3. 每皿沿壁加入1.5ml 0.25胰酶铺匀后置37孵育箱消化3min。 4. 每皿沿壁加入3.5ml ES培养基终止消化充分吹打使大部分细胞都处于单个悬浮状态注意10ml移液管吹打次数约15次/皿如遇吹打不散的情况请检查吹打力度及胰酶活性。 5. 将细胞悬浮液加入50ml离心管轻轻吹打混匀。 6.
22、 计数细胞。台盼蓝40ul细胞悬液20ul稀释倍数3倍 7. 取出1.2x107的细胞悬液加入50ml离心管中。 8. 1200rpm、4离心5min。 9. 吸走上清轻轻拍散细胞加入20ml 冰浴的PBS后重悬混匀。 10.1200rpm、4离心5min。 11.重复步骤910一次。 12. 将高速离心除菌的线性化DNA悬液转入1.5ml无菌EP管中注 20 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 意高速离心机12000rpm5min弃50ml离心管上清用手轻轻拍散细胞加入适量冰浴的无酚红RPMI重悬混匀后转入含DNA的1.5ml无菌离心管中轻轻混匀。注意重悬细胞的RPMI悬液与重悬DNA
23、的PBS悬液总体积需严格控制在800ul 13. 冰水浴5min转入冰浴的4mm电击杯中。 14. 280V500uF进行电击记录电击时间一般为10-13ms。 15. 将电击杯冰水浴5min后常温静置5min。 16. 将电击杯内的细胞悬液转入含40ml ES培养基的50ml离心管中轻轻吹打混匀均分至4个含饲养细胞的100mm平皿。 16. “8”字水平轻摇平皿使细胞均匀分布于皿底上。 17. 标记后37C、5 CO2孵育箱培养20小时后更换G418培养基。 PS关于加电转对照的方法及电转前的细胞准备 取同一批进行电转的野生型干细胞3x106用800ul 无酚红RPMI重悬后进行电击将细胞悬
24、液转入10ml培养基的15ml离心管中吹打混匀后铺至1个含MMC饲养细胞的100mm平皿其他步骤与电转细胞步骤相同。 电转前的干细胞需至少传代两次后方可进行电转。最后一次传代以6x105/皿准备6个100mm平皿于两天后进行电转。 挑克隆 21 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 实验前的准备 1取出G418培养基、PBS、DPBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 2提前一天准备铺有MMC饲养细胞的96孔板观察有无污染 1. 在圆底96孔板中加入40ul/孔的0.05胰酶置冰上备用。 2. 吸走平皿内的G418培养基。 3. 每皿沿壁加入5ml PBS轻轻摇晃后吸出清洗两遍后每皿加入6ml含
25、钙镁离子的DPBS备用。 4. 解剖显微镜1.5倍物镜下用200ul无菌枪头从100mm平皿中挑出未分化的单个克隆将单克隆转至含有0.05胰酶的冰浴圆底96孔板中注意选择20ul单道枪、量程调至15ul需严格控制时间在30min内挑完一个96孔板每挑选一个单克隆后都需更换枪头每个课题需挑4个96孔板。 5. 将含单克隆的圆底96孔板置37孵育箱消化3min。 6. 每板加入100ul/孔 G418培养基终止消化用排枪吹打混匀后转至含50ul/孔 G418培养基、铺有MMC饲养细胞的平底96孔板中。注意每次吹打混匀细胞悬液转入新96孔板后都需更换枪头排枪吹打时量程不要超过150ul 7. 标记后
26、37C、5 CO2孵育箱培养。 22 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 关于挑克隆后的后续实验 1.2-3天后96孔板一分三80汇合度标记分化的孔标记为1-11-21-DNA。 2.观察细胞情况2天后80汇合度将1-11-2冻存。 3.次日继续观察细胞情况将1-DNA一分二标记为1-DNA-11-DNA-2观察细胞长势约3-4天后冻存DNA板。 23 2012北京百奥赛图基因生物技术有限公司 胚胎干细胞冻存100mm 实验前的准备 1制备冻存液 FBSDMSO 91用锡纸包裹离心管标记后4避光备用。 注意冻存液常温具有细胞毒性且不稳定需现用现配 2取出ES培养基、PBS常温备用0.25
27、胰酶冰浴备用 3标记冻存管 1. 吸走100mm平皿内的ES培养基。 2. 每皿沿壁加入5ml PBS轻轻摇晃后吸出清洗两遍。 3. 每皿沿壁加入1.5ml 0.25胰酶 铺均至平皿后37孵育箱消化3min。 4. 每皿沿壁加入3.5ml ES培养基终止消化充分吹打使大部分细胞都处于单个悬浮状态。注意吹打次数约15次/皿如遇吹打不散的情况请检查吹打力度及胰酶活性 5. 将细胞悬浮液加入50ml离心管轻轻吹打混匀。 6. 计数细胞。台盼蓝40ul细胞悬液20ul稀释倍数3倍 7. 1200rpm、4离心5min。 8. 吸走上清用手轻轻拍散细胞加入适量冻存液混匀后加入标 24 2012北京百奥赛
28、图基因生物技术有限公司 记好的冻存管后迅速转入-80注意每管1ml冻存液冻存细 胞规格为1x106 9. 将冻存管封口膜包裹后置泡沫盒-80C 过夜次日转液氮冻存。 胚胎干细胞冻存96孔板 实验前的准备 1制备冻存液 FBSDMSO 82用锡纸包裹离心管标记后4避光备用。 注意冻存液常温具有细胞毒性且不稳定需现用现配96孔板的冻存液比例与其他冻存液不同 2取出PBS常温备用0.05胰酶冰浴备用 1. 吸走96孔板内的ES培养基。 2. 每板沿壁加入100ul/孔 PBS轻摇后吸出清洗两遍。 3. 每板沿壁加入50ul/孔0.05胰酶铺匀后置37孵育箱消化3min。 4. 每孔沿壁加入50ul 冻存液终止消化吹打混匀。注意吹打次数控制在20次内且排枪量程不得超过100ul否则会出现过多泡沫每吹打混匀一排后需更换新的枪头.
