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1、苏州大学医学院医学二系教案课程 临床免疫学和免疫检验 授课人 石怡珍 授课时间2010年10月27日专业 医学检验 年级 2007 班级 学生人数 30 教材 临床免疫学和免疫检验 主编王兰兰 出版单位人民卫生出版社 出版日期2007年7月章节第七、十章教材页数第69-80页至第109-118页题目第七章 放射免疫技术、第十章 化学发光免疫分析技术目的要求1.掌握放射免疫技术的基本类型及原理2.掌握标记物制备类型，熟悉制备和纯化方法3.掌握标记物及抗血清的鉴定参数。4.掌握放射免疫分析测定方法，了解测定设备。5.了解放射免疫技术的临床应用。6掌握化学发光免疫分析类型特点及原理7熟悉临床应用授课
2、内容 、安排 、方法 、重点难点及时间分配一、 讲授内容：1. 放射免疫技术的特点2.放射免疫分析3.免疫放射分析4.放射免疫技术的应用5化学发光免疫分析技术类型及原理、临床应用二、方法：讲课采用Powerpoint多媒体幻灯的形式。三、重点难点：重点讲解放射免疫分析原理，标准曲线质控参数，免疫放射原理及其与放射免疫的区别，各类化学发光免疫分析的特点。难点讲解标记物制备类型，制备和纯化方法四、时间分配：1. 放射免疫技术的特点 20分钟2.放射免疫分析 20分钟3.免疫放射分析 10分钟4.放射免疫技术的应用 10分钟5化学发光免疫分析60分钟教媒具体及课多件方法：Powerpoint多媒体幻
3、灯具体教学内容历史：1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel奖。第一节放射免疫技术的特点1.放射免疫技术的基本类型：放射免疫分析是体外放射分析最有代表性的一类检测技术。另外还有放射受体分析、蛋白质竞争结合分析、放射酶促分析等。 免疫放射分析、受体放射分析是典型的非竞争性体外放射分析。此外。还有酶的放射化学测定、酶的激活剂或抑制剂测定法等。2.常用的放射性核素：125I3.标记物制备类型，制备：方法1）直接法：最常用于肽类、蛋白质、酶的碘化标记，采用化学或
4、酶促氧化反应直接将125I结合于被标记物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。2）间接法：联接标记最常用。主要用于小分子化合物的标记。4.标记物的纯化1）.凝胶过滤法（Sephadex G-50柱层析分离较常用）2）.离子交换层析法3）.聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）4）.高效液相色谱法（HPLC）5.标记物的鉴定1）放射化学纯度，一般要求大于95%2）免疫活性3）比放射性：单位化学量标记物中所含的放射性强度。第二节放射免疫分析1.放免分析竞争结合基本原理及定义：是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗
5、原浓度的技术标准曲线：如果采用系列已知浓度的标准品在相同条件下进行分析，测得各标准点的结合率(B/F)，以结合率对标准品量作图，可以得到一条标准曲线。通过这条标准曲线即可查得未知浓度的待测样品的含量。标准曲线常用数据处理方法：log-logit坐标系及线性回归法是目前公认比较好的拟合方法，它是以结合率的logit值为纵坐标，以标准品浓度的对数值为横坐标，制成散点图，然后用最小二乘法对各散点进行直线回归，得出回归方程，获得标准曲线，可用计算机或计算器完成。标准曲线质控参数：B0%:30%-50%,有效期内稳定; NSB%: 30%; 标准曲线直线回归的a,b值稳定,r 0.99; ED25,ED
6、50,ED75稳定常用B与F分离的方法：免疫分离法：利用抗原抗体结合形成的复合物 化学分离法：PEG等 物理分离法：电泳、层析、离子交换、活性炭或树脂吸附等生物分离法：葡萄球菌A蛋白（SPA）固相分离法：包被试管、塑料球、磁化分离技术等。 第三节免疫放射分析1.免疫放射分析的基本原理：也是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合。因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关。为非竞争性结合分析。 AgAb*(过量)=Ag.Ab*Ab*方法：单位点法双位点法(Ab1为McAb)双位点法(Ab2为McAb)标记第三抗体法2.IRMA与RIA的异同点：
7、均为以抗原抗体的免疫反应为基础，测定对象为物质的抗原； RIA 为竞争性，标记物为抗原 结合部分放射性与待测抗原浓度呈负相关,在直角坐标系呈曲线为了产生竞争,抗体仅使用结合50%抗原的量,故灵敏度较免放法低IRMA为非竞争性，标记的是抗体，且为过量（高滴度） 结合部分放射性与待测抗原浓度呈正相关， 因抗体为过量，抗原全量参与反应，反应更为迅速，灵敏度高 标准曲线工作范围大 由于使用单抗，其特异性好 免疫放射分析仅适用于多肽和蛋白质大分子物质的测定 因使用固相法，操作更简便，易于分离（固相材料有多种）第四节放射免疫技术的应用甲状腺激素及有关激素垂体激素肿瘤疾病及其它 心血管系统 消化系统 第一节
8、 概 述一、化学发光化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。二、化学发光效率化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率（EM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。第二节 化学发光剂和标记技术一、化学发光剂
9、在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。二、发光剂的标记技术第三节 化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。二、化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（chemiluminescence e
10、nzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。三、电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。电化学发光免疫测定是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物，是目前最先进的标记免疫测定技术 。四、临床应用
