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1、 阿立哌唑微生物限度检查法验证方案文件编码HD1109010-00-2Copy 安装位置房间号起草人日期验证小组会签项目负责人：验证管理员：QC室主任：QA室主任：设备动力室主任：质量部经理：日期：日期：日期：日期：日期：日期：验证记载 批准日期 执行日期 00分发单位1 主题内容 本方案规定了阿立哌唑微生物限度检查细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证。2 适用范围：本方案适用于阿立哌唑微生物限度检查。3 职责项目负责人：负责起草验证方案及实施，并对实验数据结果准确性负责。验证管理员：起草验证方案，负责验证协调工作，收集验证资料、数据并出具验证报告。QC室主任：负责审核验证方案，并
2、监督验证方案实施。QA主任： 负责审核验证方案。质量部经理：负责验证方案的批准。4 概述 根据中华人民共和国药典2010版的规定，阿立哌唑需进行细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌的测定，为保证检验结果的准确可靠，特制定本方案对阿立哌唑的微生物限度检查方法进行验证。根据中国药典2010年版一部附录XC“微生物限度检查法”指导，验证管理规程、阿立哌唑质量标准、微生物限度检查SOP，对阿立哌唑的微生物限度检查方法进行验证。5 验证目的：通过阿立哌唑微生物限度方法的验证，确保所采用的微生物限度检查方法适合于阿立哌唑的微生物限度检查，确保检验在结果的准确可靠。6 验证内容：细菌、霉菌及酵母菌计数方法、控制菌
3、检查方法 供试液的制备-细菌（试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂对照组）-霉菌和酵母菌（试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂对照组）-控制菌检查方法（菌液制备、供试液对照组、试验组、阴性菌对照组、阴性对照组）6.1 菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特征。 大肠埃希菌 （Escherichia coli） CMCC（B）44 102 金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus） CMCC（B）26 003 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） CMCC（B）
4、63 501白色念珠菌 （Candida albicans） CMCC（F）98 001黑曲霉 （Asprgillus niger） CMCC（F）98 0036.2 菌液制备 （见附表一）6.2.1 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经3035培养1824小时。取营养肉汤培养液1ml加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml, 分别制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8菌悬液，再分别取各稀释级的菌悬液1ml, 注入平皿中,倾注营养琼脂培养基, 摇匀，凝固,经3035培养1824h,取出计数。每种菌种各稀释级平行制
5、备2个平皿。取计数范围在50100cfu菌悬液为验证时的使用菌液。6.2.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，经2328培养2448小时，取改良马丁培养物1ml加入0.9%无菌氯化钠溶液9ml, 10倍递增稀释至每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液为验证时的使用菌液。6.2.3 接种黑曲霉菌液时,关掉净化工作台风机,操作时靠近酒精灯,轻拿轻放。将黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，经2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml） 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花）至无菌试管内，用含0.05%（ml
6、/ml） 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释至每1ml含孢子数为50100cfu的孢子悬液为验证时的使用菌液。6.2.4 操作完毕后的菌液和使用过的器具经121湿热灭菌30分钟，再作清洁处理，并对操作台面进行消毒和清洁处理。6.3供试液的制备取阿立哌唑10g，加入在100mlPH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液中，45水浴保温，使完全溶化，振摇后，作为1：10供试液。 7 验证方法：进行3次独立平行试验,分别计算各试验菌每次试验的回收率。7.1细菌大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（试验组）取1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，再注入1ml大肠埃希菌备用菌液，立即倾注营养琼
7、脂培养基，摇匀，待凝固后，置3035培养3天，计数。同法再制备1份平行样。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验组照大肠埃希菌试验组同法制备。（菌液组）取大肠埃希菌菌备用菌液1ml，注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置3035培养3天，计数。同法再制备1份平行样。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液组照大肠埃希菌菌液组同法制备。（供试品对照组）取1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置3035培养3天，计数。同法再制备1份平行样。（稀释剂对照组）取pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液1ml，注入无菌平皿中，再注入1ml大肠埃希菌备用菌液，立即倾注
8、营养琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置3035培养3天，计数。同法再制备1份平行样。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌稀释剂对照组照大肠埃希菌稀释剂对照组同法制备。7.2 霉菌和酵母菌 白色念珠菌、黑曲霉（试验组）取1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌备用菌液，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置2328培养5天，计数。同法再制备1份平行样。 黑曲霉试验组照白色念珠菌试验组同法制备。（菌液组）取白色念珠菌备用菌液1ml，注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置2328培养5天，计数。同法再制备1份平行样。 黑曲霉菌液组照白色念珠菌菌液组同法制备。
9、（供试品对照组）取1:10供试液1ml，注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置2328培养5天，计数。同法再制备1份平行样。（稀释剂对照组）取pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液1ml，注入无菌平皿中，再注入1ml白色念珠菌备用菌液，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀，待凝固后，置2328培养5天，计数。同法再制备1份平行样。 黑曲霉稀释剂对照组照白色念珠菌稀释剂对照组同法制备。 7.3 结果判断：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌
10、落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70，照该供试液制备方法和计数法测定；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70，应应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。8 控制菌检查方法的验证8.1 供试液对照组：取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，置3035培养1824小时，取培养后的胆盐乳糖培养基0.2ml，接种至5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366mm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管
11、的管壁加入23滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。若MUG、靛基质同为阳性，则判检出；若均为阴性，则判未检出；若有一项阴性则取胆盐乳糖的培养物划线接种于曙红亚甲蓝或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上无菌生长或与形态与标准不符，则判未检出，若相符或疑似，应进行分离、纯化、染色、镜检及适宜的鉴定试验。8.2 试验组：取1:10供试液10ml和大肠埃希菌备用菌液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，参照供试液对照组进行试验，并对结果进行观察。8.3 阴性菌对照组：取金黄色葡萄球菌备用菌液1ml加入100ml胆盐乳
12、糖培养基中，参照供试液对照组进行试验，并对结果进行观察。8.4 阳性菌对照组：取大肠埃希菌备用菌液1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，参照供试液对照组进行试验，并对结果进行观察。8.5 阴性对照组取pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液10ml加入胆盐乳糖培养基中，参照供试液对照组进行试验，并对结果进行观察。8.6 结果判断阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。附表一 菌液制备记录营养琼脂培养基批号
13、： 玫瑰红钠琼脂培养基批号： 营养肉汤培养基批号： 氯 化 钠 批 号： 改良马丁培养基批号： 名称大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉代数培养时间培养温度稀释级皿号1皿号2皿号1皿号2皿号1皿号2皿号1皿号2皿号1皿号210-110-210-310-410-510-610-710-8选用稀释级检验人： 复核人： 日期： 附表二 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录供 试 品 批 号： 玫瑰红钠琼脂培养基批号： 营养琼脂培养基批号： 一、大肠埃希菌（选用稀释级： ）培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，设备型号： 温度： 试验组菌液组供试液对照组稀释剂对照组稀释剂对照组回收率
14、=稀释剂对照组/菌液组100%试验组回收率=（试验组-供试液对照组）/菌液组100%皿号1皿号2 平均菌落数检验人： 复核人： 日期： 二、金黄色葡萄球菌（选用稀释级： ）培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，设备型号： 温度： 试验组菌液组供试液对照组稀释剂对照组稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组/菌液组100%试验组回收率=（试验组-供试液对照组）/菌液组100%皿号1皿号2 平均菌落数检验人： 复核人： 日期： 三、枯草芽孢杆孢菌（选用稀释级： ）培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，设备型号： 温度： 试验组菌液组供试液对照组稀释剂对照组稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组/菌液组1
15、00%试验组回收率=（试验组-供试液对照组）/菌液组100%皿号1皿号2 平均菌落数结论： 检验人： 复核人： 日期： 四、白色念珠菌（选用稀释级： ）培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，设备型号： 温度： 试验组菌液组供试液对照组稀释剂对照组稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组/菌液组100%试验组回收率=（试验组-供试液对照组）/菌液组100%皿号1皿号2 平均菌落数检验人： 复核人： 日期： 五、黑曲霉（选用稀释级： ）培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，设备型号： 温度： 试验组菌液组供试液对照组稀释剂对照组稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组/菌液组100%试验组回收率=（试验组
16、-供试液对照组）/菌液组100%皿号1皿号2 平均菌落数结论： 检验人： 复核人： 日期： 附表三：控制菌检查方法验证记录供 试 品 批 号： 胆盐乳糖培养基批号： MUG培养基批号： 大肠埃希菌检查（培养时间： 年 月 日 至 年 月 日 ，培养温度： ）阴性对照组试验组阴性菌对照组阳性对照组供试液对照组MUG靛基质曙红亚甲基蓝琼脂培养基上菌落形态：紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无色透明暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽曙红亚甲基蓝琼脂观察结果麦康凯琼脂培养基上菌落形态：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂观察结果革兰氏染色镜检生化反应靛基质试验甲基红试验VP试验枸橼酸盐利用试验结果检查结果结论： 检验人： 复核人： 日期：
