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1、食品微生物快速检测方法的研究进展农产食品科技2010,4(2):4851AgriculturalFoodProductsScienceandTechnolog食品微生物快速检测方法的研究进展孟甜,李玉锋(西华大学生物工程学院,四川成都610039)摘要:微生物是影响食品安全最重要的因素之一,科学家们一直在寻找快速检测微生物的方法.本文讲述了快速检测方法的发展历程,从传统的琼脂平板培养法到现代的免疫法,分子生物学方法,仪器联用等方法,并对快速检测方法作出展望.关键词:食品微生物;快速检测方法中图分类号:TS207.4文献标识码:BResearchonFastDetectionMethodsfor
2、FoodMicroorganisrnsMENGTian.LIYufeng(CollegeofBioengineering,XihuaUniversity,Chengdu610039,China)Abstract:Microorganismsareoneofthemostimportantfactorswhichaffectfoodsafety.Scientistshavebeenseekingforfastdetectionmethodsofmicroorganisms.Thisarticledescribedthedevelopmentprocessoffastdetectionmethod
3、s,fromtraditionalagarplateculturemethodtomodernimmunology,molecularbiologyandcombinedinstrumentsuseandSOon,aswellastheprospectoffastdetectionmethods.Keywords:Foodmicroorganisms;Fastdetectionmethods食品是人类赖以生存的物质基础,其安全性直接关系到人类的健康发展.微生物是影响食品安全最重要的因素之一,食品中存在的微生物种类,数量不仅决定了食品货架期,也是评价食品安全性的主要指标I.如何快速,高效,准确的
4、检测和评价食品中的微生物一直以来都是全球研究的热门问题.特别是近年来,随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏,可导致人类感染的致病菌的种类越来越多,病原微生物对人类的威胁越来越大【.1快速检测方法的过去1.1琼脂平板培养法1881年,Robertkoch首次引入琼脂平板培养法用以检测微生物【3】.后来,随着食品,药品等对微生物的要求,琼脂平板培养法逐渐用于快速检测微生物.主要有选择性培养基快速检测和显色培养基快速检测.1.1.t选择性培养基方法收稿日期:20100423作者简介:孟甜(1985一),女,硕士,研究方向:食品技术.通讯作者选择性分离培养基是利用目的微生物对各种化学物质敏感程度的差
5、异,在培养基中加入选择性抑制剂,用以抑制非目的微生物生长,使目的微生物生长的培养基.例如:啤酒企业所处环境不同其污染菌群不同,检测啤酒污染菌使用的培养基也不同.如使用NBBA及NPS培养基所做的不同培养时间的实验.使用NPS培养基可以较为准确的检测出啤酒中厌氧有害微生物的数量(主要为乳酸菌).若样品污染较为严重,使用NBBA培养基也可比较准确的检测出结果.这两种培养基因加人了啤酒酵母抑制剂,生产用酵母不能在其上面生长I1.因此使用选择性培养基快速检测与一般检测方法相同,只是培养时间短而已.1.1.2显色培养基方法用显色培养基快速鉴定微生物是一种相对较新的方法,该技术以生化反应为基础,通过在培养
6、基中加入细菌特异性酶的显色底物,直接根据菌落颜色对菌种作出鉴定,常用于食源性致病菌检测【51.如李斯特菌(Listeriaspp)是一类个体较小的革兰氏阳性杆菌.近年来,许多国家致力于李斯特菌显色培养基的研究,针对李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶(PIPLC)和13一D葡萄糖苷酶设计显色底2010孟甜等:食品微生物快速检测方法的研究进展49物对李斯特菌进行快速检测.但是,该方法也存在一定的问题,如检测混合感染微生物时,常会造成目标菌漏检和检测结果假阴性;对检测结果不能定量分析等,因此显色培养基的设计尚待优化.1.2显微镜镜检法显微镜镜检法是比较常规的检测方法,一般观察微生物的形态和定量检测.主要步
7、骤是:(1)样品的处理:使用显微镜检测样品中的微生物浓度要高,因此,对于一般样品而言,一定要先富集后镜检.富集的方法一般采用膜过滤法,即把一定数量的样品经过膜过滤后把滤膜放在适量的无菌水中,摇动,振荡,然后检测无菌水中微生物的数量及形态.(2)镜检在洁净的载玻片上滴一滴准备好的菌液,盖上盖玻片,再滴一滴香柏油,使用油镜检测,也可用计数板计算微生物的数量,然后换算成需要的单位数量.2快速检测方法的现状由于过去传统的快速检测技术存在诸多问题,近年来为了能快速,方便,正确地检验食品微生物,许多国家对此进了研究,并取得了进展.通过引用微生物学,化学,生物化学,生物物理学,免疫学以及血清学试验技术等对微
8、生物进行分离,检测,鉴定和计数.与传统方法比较,更快,更方便,更灵敏1.2.1气相色谱法气相色谱法(GC)是英国生物化学家诺贝尔奖金获得者A.J.P.Martin等人1952年创立的一种新型的物理及物理化学的分离分析方法.1963年Able等首次通过细胞脂肪酸的分析来进行细菌分类,几乎与此同时Oyama等又提出用裂解气相色谱法鉴定细菌.将微生物细胞经过水解,甲醇分解提取以及硅烷化,甲基化等衍生化处理后,使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析.不同的微生物所得到的色谱图中,少数的峰具有特征性,可被用来进行微生物鉴定,分析检测各种常见细菌,酵母菌,霉菌等.2.2以免疫学为基础建立的方法2.
9、2.1酶免疫测定技术酶免疫测定技术(EIA)是将抗原或抗体吸附于固相载体,在载体上进行免疫酶染色,底物显色后,通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量,可根据抗原抗体反应是否需要分离结合和游离的酶标记物而分为均相和非均相两种类型.非均相法较常用,包括液相和固相免疫测定法.固相免疫测定法的代表技术是酶联免疫吸附技术(ELISA)191.该法具有可定量,反应灵敏准确,标记物稳定,范围宽,结果判断客观,简便完全,检测速度快以及费用低等特点,且同时可进行上千份样品的分析.2.2.2免疫层析技术免疫层析(Ic)是20世纪80年代初发展起来的快速免疫分析技术,它将免疫学原理和层析原理相结合,
10、借助毛细管的作用,样品在条状纤维制成的膜上泳动,其中的待测物与膜上一定区域的配体结合,通过酶促显色反应或直接使用着色标记物,在短时问(20min内)便可得到直观的结果.按其原理可分为两类,一类以酶促反应显色为基础,以显色高度来定量;另一类则使用着色标记物如乳胶颗粒,胶体硒,胶体金以及脂质体等.利用免疫层析原理开发出的各种食品微生物检测试纸条,具有很好的应用价值.2.2.3免疫荧光技术免疫荧光技术(IFT)就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应.在实际应用中主要有直接法和间接法.直接法是在检测样品上直接滴加已
11、知特异性荧光标记的抗血清,经洗涤后在荧光显微镜下观察结果.间接法则是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体,待作用后经洗涤,再加入荧光标记的第二抗体.该技术的主要特点是有特异性强,敏感性高,速度快,但仍存在不足,如非特异性染色尚未完全解决,结果判定客观性不足,技术程序比较复杂.2.2.4酶联荧光免疫分析技术酶联荧光免疫分析技术(ELFIA)是在酶联免疫吸附分析的基础上发展起来的一种快速检测微生物的方法.将酶系统与荧光免疫分析结合起来,在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物,可提高分析的灵敏度和增宽测量范围,减少试剂的用量.目前,将酶放大技术,固相分离及荧光检测三者联合将会成为荧光免
12、疫分析中最灵敏的方法.2.2.5免疫印迹技术免疫印迹(immunoblotting)法分三个步骤:第一,聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE).将蛋白质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区农产食品科技带.第二,电转移.目的是将凝胶中己分离的条带转移至硝酸纤维素膜上.第三,酶免疫定位.该步的意义是将前两步中已分离,但肉眼不能见到的抗原带显示出来.将印有蛋白抗原条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体和酶标记的第二抗体反应后,再与能形成不溶性显色物的酶反应底物作用,最终使区带染色.免疫印迹法综合了SDSPAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性,是一种有效的分析手段,目前广泛应用于酵母和真菌
13、的检测中.2.2.6乳胶凝集试验乳胶凝集试验(LAT)是用人工大分子乳胶颗粒标记抗体,使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应,以达到检测目标病原微生物或毒素的目的.如用于检测食品中金黄色葡萄球菌的AureusTes试剂盒,该试剂的聚苯乙烯乳胶粒子中含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白的IgG,当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂中后,A蛋白和IgG结合,凝聚酶和鞭毛抗原结合,lrain内将产生凝聚反应.该法的灵敏度和特异性均较高.2.2.7免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法(IMS)是将磁性微球与免疫化学技术结合起来的一种方法.该方法是先用抗体包被的磁珠与样品混合,再用一个磁场装置收集磁珠.该方
14、法可快速的从食品成分中分离出靶细菌,克服了选择性培养基的抑制作用问题.免疫磁珠分离法和其它检验方法联合,如酶联免疫吸附分析(ELISA),多聚酶链式反应(PCR),荧光免疫分析(IFA),电子化学发光(ECL)相结合,则可数倍地提高分离效率和检测极限.2.3以传感器为原理建立的方法2.3.1生物传感器生物传感器的基本原理是通过被测定分子与固定在生物接受器上的敏感材料发生特异性结合,并发生生物化学反应,产生热焓变化,离子强度变化,pH变化,颜色变化或质量变化等信号,且反应产生的信号的强弱在一定条件下与特异性结合的被测定分子的量存在一定的数学关系,这些信号经换能器转变成电信号后被放大测定,从而间接
15、测定被测定分子的量l】oJ.有试验已成功表明,采用酶免疫电流型生物传感器可实现对存在于食品中少量的沙门氏菌,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等的检测.生物传感器特点是高特异性和高灵敏度,其高特异性是由生物分子特异性识别所决定的.2.3.2基因传感器基因传感器就是把已知核苷酸序列的半单链DNA分子固定在传感器上(也称ssDNA探针)和另一条互补的ssDNA(目标DNA)杂交,形成双链DNA(dsDNA)后会表现出一定的物理信号,再通过换能器反映出来.目前,基因传感器主要有石英晶体振荡器(QCM)质量式基因传感器,表面等离子谐振(SPR)光学式DNA传感器等.Uramatsu等采用抗体压电晶体生物传感器测
16、定大肠杆菌,检测细菌下限为105个/mL.基因传感器使对目的DNA测量时间大大缩短,且操作简单,灵敏度高.2.4以分子生物学为基础建立的方法2.4.1PCR技术理论PCR是1985年由美国KaryMullis等人首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法.用该方法可使微量特定DNA片段几小时内迅速扩增至百万倍.由于PCR技术具有特异性强,灵敏度高和快速准确的特点,因而发展迅速,不仅用于基因方面的基础研究,而且在医学,食品科学,农业科学等领域也发挥着极其重要的作用.利用PCR检测细菌,可以快速,灵敏的检测样品中是否存在某些细菌或致病菌,尤其是那些人工无法培养的细菌.用于检测啤酒中淀
17、粉酵母和啤酒酵母,水体中大肠杆菌和大肠菌群.另外,肉毒梭菌,沙门氏菌等病菌都有用PCR方法检测的报道.但是也有局限性,仅限于那些核酸序列已知的微生物的鉴定,在啤酒腐败菌检测中不能得知所提取的DNA是来自于活细胞还是死细胞,同时定量操作的能力也显得不足.2.4.2基因芯片将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面,微生物样品DNA经PCR扩增后,制备荧光标记探针,然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交,最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物.Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时,设计了一种鉴别诊断芯片,一方面从高度保守基因序列出发,即以各菌种问的差异序列为靶基因,另一方面选择
18、同种细菌不同血清型所特有的标志基因为靶基因,固着于芯片表面,同时含有细菌所共有的16SrDNA保守序列以确定为细菌感染标志,不仅敏感度高于传统方法,且操作简单,重复性好.2010孟甜等:食品微生物快速检测方法的研究进展5l2.5估计微生物数量和菌量的方法化学发光是利用可发光化学物质测定被分析物质的浓度.所有生物体的磷酸核苷酸(ATP)含量是相对固定的,当萤火虫酶系统和ATP接触时,发生光生物学反应,就会发光.在荧光素和荧光酶过量时,荧光强度与ATP含量成正比关系;阻抗测定是当细菌生长时,将大分子物质降解成小的带高电荷的粒子,从而改变培养基的导电性能;放射测薰法则利用细菌代谢碳水化合物而产生CO
19、的原理,把微量的放射性标记引入葡萄糖或其他糖类分子中,糖被利用并放出含放射标记的CO,这一方法适用于测定食品中的细菌.接触酶实验是利用接触酶反应来估计食品中微生物含量,设计出的仪器称为接触酶测定仪.2.6微生物自动检测法美国麦道保健系统公司制造了种称作VitekAMS的微生物自动检测系统,其最大特点在于同微生物检测应用的传统方法有着明显的变革,它无须经过微生物分离培养和纯化的过程.能直接从样品中检出特殊的微生物种类和菌群来.麦道公司在原有ViteckAMS的基础上,推出第二代检测系统,即Viteck免疫诊断检测系统(DAS).它是集固相吸附,酶联免疫,荧光检测和乳胶凝集试验诸方法优点于一体的综
20、合性检测系统ll21.2.7”即用胶”测定法“即用胶”测定法是把lmL食物样品倾人一盛有无菌液体培养基的试管中,混匀后再将混合物倒人一个装有胶质的特殊培养皿中.混合物与胶质接触后便形成琼脂相似的复合物,经培养后便可计数菌种及数量.该系统是包装好的产品,用时不需灭菌,极适合野外测定.目前,这种系统正在受到美国AOAC的鉴定.2.8阻抗测定法在含有几种不同底物的培养基中,分别接种适量的被检微生物,经一定时间培养后即可用阻抗测量仪在检测其生长情况的同时也表达出特征,进而鉴别其种,属.此法广泛用于细菌,酵母菌,霉菌和支原体等的检测和鉴定,具有高敏感性,特异性,快反应性和高度重复性等优点.目前市售商品有
21、英国MalthuSMicroBiolAnalyser系统,它是测定电导率的变化.另一种是美国Bactometer微生物监控系统,它是测定阻抗变化.2.9自动旋转平板测数法通过螺旋制板机将0.035mL液态样品以阿基米德螺线的形式接种在琼脂平板上,输样量随着输液管从平板中心向边缘的移动而减少.经过培养后,将平板放在计数格上,此格划分成一些已知面积的区间,菌落数即在此区间内计数.此法已被AOAC推荐为法定方法,在美国广泛采用l13I.3展望微生物的快速检测技术一直在不断发展,相信随着科学技术的不断进步有更多新的技术和方法不断涌现,随着新型设备的使用及联用(如气相色谱一原子吸收联用,气相色谱一质谱联
22、用等),将来的食品微生物检测将更加快速,灵敏,简便Il41.食品安全问题一直都是引起人们广泛关注的全球性问题之一,长期以来,科学家们都在寻求简单,快捷,准确的快速检测方法,从传统烦琐费时的琼脂平板培养法到现代方便,灵敏的各种免疫法,分子生物学及仪器联用等方法,虽然有些技术方法还存在不完善,不足的地方,但是各国的专家都在致力于改善或寻求更加科学,更加完善的快速检测技术,相信不久的将来食品微生物技术一定能更好服务于人类!参考文献:1】苏凤贤,张宝善,曹稳.食品微生物快速检测技术应用进展J.陕西农业科学,2007(2):7881.【2】赵冬云.快速检测食品中微生物方法的进展.实用医技杂志,2007,
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