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1、,Genetic Engineering,1.基因工程概述2.基因工程的基础知识与基本技术3.基因工程所需基本条件4.基因工程的操作过程5.目的基因的获取6.克隆基因的表达7.转基因生物技术,一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,5.目的基因的获取,目的基因：,准备要分离、改造、扩增或表达的基因。,5.目的基因的获取,基因组DNA片断化,化学合成目的基因,目的基因的保存和扩增,目
2、的基因的分离和扩增,第一节 基因组DNA片断化,一、限制性内切酶法,用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。,酶切,由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。,1.优点,2.缺点,目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,二、随机片断化,1.限制性内切酶局部消化法,控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。,内切酶识别位点的碱基数,影响所切出的产物的长度和随机程度。,限制性内切酶的选用原则,1）4bp的内切酶,平均每46（4096）bp一个切点。,2）6bp的内切酶,平均每44（256）b
3、p一个切点。,随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。,内切酶粘性末端,能与常用克隆位点相连。,（Sau3ABamH I）,2.机械切割法,（1）超声波,超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。,（2）高速搅拌,1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。,1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。,第二节 化学合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亚磷酸三酯法、,固相合成法,自动化合成法、,保护dNTP的5端P 或3端-OH
4、,用酸或碱的脱保护,（1）原理,1.磷酸二酯法,带保护的单核苷酸连接,保证合成反应的定向进行。,带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。,（2）合成过程,下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合,原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。,2.磷酸三酯法,DMT：二甲氧基三苯甲基,将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,目前通用的合成方法。,合成的二核苷酸连接处有三个酯键！,固相磷酸三酯合成过程：,固相支持物,结果是全保护的DNA：5 DMT,3固相支持物,核苷酸之间对氯苯，
5、最后脱保护,固相 支持物,固相 支持物,C,O,H,G,H,H,H,H,O,CH,2,O,DMT,P,O,Me,N,CH,Me,Me,CH,Me,Me,H,DMT：二甲氧基三苯甲基,激活,缩合,氧化,脱取代基,玻璃珠,连接臂,化学合成的DNA片断一般在200bp以内。,二、化学合成DNA片断的组装,用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。,1.互补连接法,预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。,（2）5端磷酸化,（1）互补配对,（合成的DNA单链的5端是-OH）,T4 DNA连接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA双链,（3）连接
6、酶连成完整双链,2.互补延伸连接法,预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。,3,5,5,3,5,3,T4DNA连接酶,Klenow片段,引物,1.直接合成基因,三、寡聚核苷酸化学合成的优点,2.合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA,3.合成探针序列,4.定点突变合成,合成带有定点突变的基因片断。,（2）有些基因比较短，化学合成费用较低,DNA合成仪,5.合成人工接头或衔接物,含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,将
7、某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。,一、基因文库的构建,1.基因文库（gene library）,第三节 目的基因的保存和扩增,（2）目前常用的载体,2.构建基因文库的载体选用,载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。,载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。,（1）对载体的要求,载体系列：容量为 24 kp cosmid载体：容量为 50 kb YAC：容量为 1 Mb BAC:容量为
8、300 kb,断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。,（1）染色体DNA大片段的制备,3.基因文库构建的一般步骤,超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。,物理切割法：,内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。,酶切法：,（2）载体与基因组DNA大片段的连接,粘性末端直接连接,载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。,如：Sau3A与BamHI的酶切末端。,直接连接、人工接头或同聚物加尾。,人工接头法（adapter）,人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。,各种酶的接头可以向公司定做或购买。,接上人工接头,粘性末端,CCC,C
9、CC,末端转移酶,粘性末端,同聚物加尾,4.基因组文库的大小,一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。,N=,ln(1-p),ln(1-f),p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）,f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数,N：所需的重组载体数（克隆数）,例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bp,N=,ln(1-p),ln(1-f),=,ln(1-99%),ln(1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大小；f：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,31
10、09,1.7104,=8.1105,1.cDNA,以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。,2.cDNA library,二、cDNA文库的构建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。,（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。（5）以mRNA为材料，适用于某些RNA病毒基因组结构研究。,3.cDNA文库的特点,注：cDNA文库包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因。,分离mRNA
11、用商业化的Oligo dT纤维柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-5%。,（2）mRNA的分离纯化,原理,mRNA的分离纯化,Column（柱）,（1）总RNA（total RNA）提取,4.构建cDNA文库的一般步骤,反转录酶,（3）cDNA的合成,cDNA第一链合成,逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分
12、子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,3,5,5,引物,cDNA第一链,3,5,引物,降解mRNA模板,或RNaseH,碱,剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。,cDNA第一链,5,cDNA第二链合成,DNA聚合酶,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第二链合成,去掉发卡结构,核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一链,cDNA第二链,5,3,cDNA第一链,c
13、DNA第二链,5,3,5,3,自我引导合成法,这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。,妙用RNaseH,小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。,DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。,mRNA,cDNA,3,5,反转录酶,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,引物,mRNA,cDNA第一链,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二链,cDNA第一链,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,大肠杆菌RNaseH酶降解取代法,dCTP,TdT,Oligo(dG)寡聚引
14、物引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAACCCCOH3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH 蔗糖梯度离心,退火 oligo(dG),Klenow,dNTPs,在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。,4cDNA与载体连接：,
15、接上人工接头,粘性末端,CCC,CCC,末端转移酶,5.cDNA文库的大小,一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目:,N=,ln(1-p),ln(1-f),p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）,f:某一mRNA丰度与细胞整个mRNA数的比值,N：所需的重组载体数（克隆数）,理论公式：细胞mRNA总数细胞中某mRNA的拷贝数,6.cDNA文库的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构。,细菌或原核生物的mRNA半衰期很短。,mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难。,仅限于克隆蛋白质编码基因。,所含遗传信息远少于基因组文库，受细胞来源或发育时期的影
16、响。,三、文库的查询（screening）,对编码产物已知的目的基因：1.根据蛋白质序列推导出核苷酸序列（或其同源基因序列），制备探针杂交分离。2.特定的蛋白质抗体或蛋白质功能测定来筛选。,对编码产物未知的目的基因：差别显示技术、差减杂交法获探针，再分离目的基因。,现要筛选时再重建文库，不用经贮藏的文库。,用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。,文库,载体,探针,电泳后杂交放射自显影,测序分析,第四节 目的基因的分离和扩增,一、目的基因的分离,1.探针柱分离特异mRNA,根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。,富集特定基因的m
17、RNA或cDNA模板。,纤 维 柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,Total mRNA,纤 维 柱,探针DNA,探针DNA,探针DNA,探针DNA,过柱,与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。,特异mRNA,洗脱,RT-PCR,2.mRNA消解杂交,减法杂交：除去两种样品中普遍共同存在的基 因序列，从而使目的基因序列得到有效富集，提高基因筛选分离的敏感性。,mRNA减法杂交：从表达目的基因的组织中提取mRNA并反转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织中提取的mRNA做过量杂交，在两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子，而目的mRNA反转录
18、的cDNA片段仍保持单链，将其分离出来即为差异表达的序列。,从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。,结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。,羟基磷灰石柱,（Hydroxylapatite column）,原理：,举例：,A,A,A组织,B组织,总mRNA（A）,总mRNA（B）,含蛋白A的mRNA,不含蛋白A的mRNA,总cDN
19、A第一链,A,杂交,内含蛋白A 的cDNA,羟磷灰石柱,过柱,吸收RNA-DNA,单链滤过,羟磷灰石柱,B,A,PCR,cDNA文库,3.mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）,mRNA differential display RT-PCR,（1）3端的锚定引物,Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、G or C N:A、G、T or C,5,3,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,A
20、A,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,（2）12种锚定引物,（3）5端的随机引物,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,扩增cDNA第一链。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二链，并PCR,（4）随机引物与锚定引物成对扩增,12种锚定引物
21、，若与20种随机引物，可组成240组引物。,引物组合：,240组在能分出20000多条带！,实验结果：,如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。,在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。,（5）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较,不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。,选择有差异的带，进一步PCR作探针。,筛选文库，找到差别基因的全长序列。,二、PCR扩增获得目的基因,1.直接从基因组中扩增,（1）提取基因组DNA作模板,（2）根据目的基因序列设计引物,（3）PCR扩增,真核生物基因组含有内含子！,适合扩增原核生物基因。,原核基因组部分,原核细胞,提取基因组DNA,PCR扩增,（1）提取基因组 total RNA,（2）反转录合成总cDNA作模板,（4）PCR扩增,（3）根据目的基因序列设计引物,2.从mRNA中扩增:RT-PCR,原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。,适合扩增真核生物基因。,目的基因 的引物1,反转录成目的基因cDNA第一链,目的基因 的引物2,目的 基因cDNA第二链,PCR,mRNA,克隆外源基因,
