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1、iPS细胞用于建立神经系统疾病模型的研究进展杜小宇 赵庆华【摘要】 2006年Yamanaka等首次将分化成熟的小鼠成纤维细胞重新诱导成为具有胚胎干细胞特性的多能干细胞，即诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)。iPS细胞克服了胚胎干细胞的伦理学和免疫排斥等缺陷，一经问世就成为了研究神经系统疾病的重要的工具。人们通过iPS技术可以较容易地获得患者特异性的疾病相关神经元和胶质细胞，为研究疾病机制，基因靶向纠正和药物选择提供了一种理想的实验模型。本篇综述旨在归纳iPS细胞用于建立神经系统疾病模型的最新进展，包括脊肌萎缩症，家族性植物神经障碍，Ret
2、t综合征，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏病和精神分裂症等，并对现存的问题及应用前景予以综述。【关键词】 诱导多能干细胞；神经系统疾病；疾病模型；个性化治疗Inducted pluripotent stem cells for modeling neurological diseasesDU Xiao-yu,ZHAO Qing-hua. Department of Orthopaedic Surgery, Shanghai First Peoples Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, ChinaCorrespondin
3、g author:ZHAO Qing-hua, E-mail:sawboneszhao【Abstract】 In 2006,Shinya Yamanaka reported that somatic cells can be reprogrammed to a pluripotent state from mouse somatic cells and termed as induced pluripotent stem (iPS) cells. The derived cells are extremely similar to embryonic stem cells (ES cells)
4、 both in epigenetically ways and in differentiated potential. Since the origin of iPS cells has no ethic limits, they have been important tools for the study of neurological diseases. By offering an unlimited source of patient-specific disease-relevant neuronal and glial cells, iPS cell-based diseas
5、e models provide a great way to study the disease mechanisms, molecular targets and drug discovery. This review focuses on the recent advancements in modeling neurological disorders, including the iPS cell-derived neurons generated from patients with spinal muscular atrophy, familial dysautonomia, a
6、myotrophic lateral sclerosis, Rett syndrome, schizophrenia and Parkinson disease, etc. Moreover, existing problems and prospect of application are also reviewed.【Key words】 Induced pluripotent stem cell; Neurological diseases; Disease modeling; Individual-specific treatment基金项目：自体脐带间充质干细胞复合纳米锶磷灰石纤维多
7、孔钛支架构建新型腰椎融合器的实验研究（YG2011MS28）作者单位：200080 上海交通大学附属第一人民医院骨科（杜小宇、赵庆华）通信作者：赵庆华，E-mail:sawbonezhao联系人(退修稿修改者)：杜小宇 shjd1308961981 18801971369 联系地址：姓名：赵庆华 版面费通知、发票、杂志既往地详细地址：上海市海宁路100号上海交通大学附属第一人民医院骨科 邮政编码：200080一、 前言神经系统疾病约占全球疾病的6.3%，由于疾病模型缺失、发病机制未明、血脑屏障阻碍药物透过等原因，目前尚无有效的药物治疗此类疾病，通过康复训练显然无法满足治疗需要。干细胞治疗技术的
8、出现突破了传统的治疗瓶颈，展现出广阔的前景。将神经干细胞移植入患者体内可以改善神经系统损伤和神经退行性病变1-3。但是神经干细胞来源极其有限，体外扩增困难，且异体细胞移植会造成免疫排斥4。2006年, 日本的Yamanaka等5首先用4个转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC将小鼠成纤维细胞转化成iPS细胞。2007年，Yamanaka等6及Thomson等7几乎同时成功得到人iPS细胞。iPS细胞具有与胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）相似的特性，表达与ES细胞类似的多能性基因，且能分化为三个胚层的细胞并具有形成嵌合体小鼠及产生纯合后代的能力。与ES细胞相
9、比，iPS细胞又有其独特的优势：其一，iPS细胞可来自多种成体细胞，取材广泛。其二，来源于患者自身的iPS细胞可以避免免疫排斥，提高细胞或器官移植的成功率。iPS的出现解决了ES细胞的难以克服的问题，成为了干细胞移植的新种子来源，具有极大的临床应用背景，是干细胞领域的一次革命。首次报道iPS细胞的Yamanaka也因此获得了2012年诺贝尔生理学或医学奖。多数神经系统疾病是由于神经元损伤和神经胶质细胞功能紊乱引起。由于这些细胞肉眼难以观察，对其病理学和分子生物学研究大多基于动物疾病模型。尽管这些替代模型对于理解疾病机制提供了一些有价值的信息，但它们的基因型和表现型与活体内受损细胞有很大差别。为
10、了研究这些疾病，人们采用了动物转基因或基因敲除模型(transgenic animals or knockout animals)模拟与人类相似的疾病，然而这些模型并不能重现疾病的所有临床表现，且啮齿类动物与人类存在着种属差异。这就限制了对这类疾病的研究。对人体疾病进行深入研究需要更接近人体发育过程的体外模型， iPS技术为其提供了一个新的思路。这项技术可以较容易地得到与人体受损细胞类似的病理性细胞，为研究人体疾病的发病机理、筛选临床药物和自体细胞移植创造了更为有价值的人体细胞模型。本文对iPS细胞作为疾病模型的最新研究成果予以综述，并简述现存的主要问题及发展前景。二、 iPS向神经系统疾病相
11、关细胞系的增殖与分化iPS细胞可以通过导入特定转录因子得到，不同组织来源的细胞可以采用不同的转录因子，但诱导效率各有不同。目前，由于操作方法较为可行，重编程效率也相对较高，所以大多数病人iPS细胞系是通过逆转录病毒转导得到的。控制外周环境可以诱导iPS细胞分化，包括各种生长因子，小分子化合物等。人们利用iPS技术已经能够分化出神经系统疾病模型所需的多种细胞系，包括胆碱能神经元，谷氨酸能神经元，多巴胺能神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和施旺细胞等。iPS细胞在经过复杂处理后可分化为神经上皮细胞，之后形成典型的神经管样玫瑰花环结构(neural tube-like rosettes)。这些原始的
12、神经上皮细胞经过维甲酸(retinoic acid)和音猬因子(sonic hedgehog)或其他信号蛋白处理后形成腹侧脊髓祖细胞（ventral spinal progenitors）。进一步分化为成熟脊髓神经元可通过添加脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor）和胶质细胞衍生神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor）等来完成，这两种因子均可促进轴突伸长8。上述过程持续3到6周不等，并可通过一系列的标志物对某种类型的细胞进行检测。其他诱导iPS细胞分化为神经系统细胞的方法还有以拟胚体作为中间步骤
13、等9。三、 利用iPS细胞建立的疾病模型尽管人们已经成功诱导了多种疾病患者来源的iPS细胞，但大多是发病时间较早，遗传缺陷明显的疾病。对于致病基因复杂的迟发疾病，建立模型则更为困难。下面将对一些常见的神经系统疾病分别进行说明，从这些例子我们可以更好地认识iPS细胞疾病模型在研究疾病机制，发现靶基因和药物选择上的价值。1.脊肌萎缩症（Spinal muscular atrophy，SMA）SMA是由于SMN基因发生点突变，SMN蛋白表达下降所致。SMN蛋白的缺少导致脊髓前角运动神经元受损，受其支配的肌肉产生病变，临床上表现为肌肉萎缩，肌无力，吞咽困难，重者发生呼吸衰竭10。2008年，Ebert
14、等11利用逆转录病毒将OCT4、SOX2、LIN28和NANOG四个转录因子导入从患有SMA的孩子身上提取的成纤维细胞中，将其重编程为iPS细胞（iPS-SMA）并诱导分化为运动神经元，首次建立了基于iPS的疾病模型。他们发现分化4周后，SMA病人的神经元在大小和数量上与对照组（正常人iPS细胞诱导分化出的运动神经元）类似，到了第6周则有一定的减少，提示SMA病人的运动神经元可以正常发育，但更容易退化。作者观察到运动神经元中一种包含SMN蛋白的核内聚集体结构（也称为gems）的减少，与SMN的减少相一致，证明SMN基因的突变与运动神经元的存活密切相关。为寻找治疗SMA的药物，他们还将iPS-S
15、MA细胞置于含有丙戊酸或妥布霉素的培养基中，发现这两种药物均可使iPS细胞内的gems增加，SMN合成量提高2-3倍，这为药物筛选提供了有力的证据。这项研究为理解SMA疾病机制提供了新的模型和平台，证明了基于iPS细胞的疾病模型用于特定遗传病的病理研究的可能性。2. 肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）ALS是一种常见的运动神经元疾病。ALS患者由于上、下运动神经元变性导致脑干，脊髓和肌肉萎缩，多因呼吸肌功能衰竭而死亡。该病预后较差，发病后的平均存活3-5年。尽管利鲁唑和碳酸锂等药物可以延缓其病情进展，但效果仍不理想。约1020%的家族性AL
16、S（FALS）和5%的散发性ALS（SALS）与超氧化物歧化酶（SOD1）基因突变有关，该基因的突变导致细胞内异常蛋白聚集。用人胚胎干细胞过量表达突变的SOD1蛋白可引起其分化的运动神经元存活能力下降和数目减少12。胶质细胞的毒性作用也可能是ALS的致病因素之一。2008年Dimos等13从两名家族性ALS患者（均存在SOD1基因L144F显性等位基因变异）身上提取体细胞，建立了SOD1基因突变的iPS细胞系，这些疾病特异性iPS细胞具有胚胎干细胞的特性，可形成拟胚体，给予音猬因子激动剂和维甲酸后，胚体逐渐分化为运动神经元。Boulting等14还建立了一个包含2名FASL患者和5名健康人的i
17、PS细胞的测试组，发现不同来源的iPS细胞系有不同的表型，但不同实验室的同一来源iPS细胞系在分化上表现出很高的一致性，说明用iPS作为某种特定的疾病模型具有很好的可重复性。疾病特异iPS细胞为阐明家族性ALS的机制提供了新的思路和方法，具有广阔前景，而散发性ALS由于与环境交互的复杂关系，目前尚不能利用体外模型进行很好的分析，成为未来研究的挑战。3.帕金森氏症（Parkinson disease，PD）PD是继老年性痴呆后的第二大神经退行性疾病，全球有超过600万的患者。该病是一种以黑质纹状体通路退变为主要特征的神经系统变性疾病，其基本病理特征是中脑黑质致密区的多巴胺（DA）能神经元选择性凋
18、亡，导致DA含量减少。PD的典型临床症状为静止性震颤，肌肉僵直，动作迟缓和姿势反射受损。尽管PD是一种可治疗的疾病，左旋多巴替代疗法是如今治疗PD最有效的内科药物，但其只能在短时间内改善患者症状，不能逆转神经元退变的进程，且病情的恶化最终会导致治疗效果下降。人们已经将患者iPS细胞分化为多巴胺能神经元并移植入大鼠脑内，在移植后12周改善了大鼠表型15,16。过去的研究中，人们找出了多个与PD相关的基因和遗传位点，如-Synuclein(SNCA)、Parkin、DJ-1、PINK1、LRRK2、NURR1等。Daley建立了LRRK2基因发生点突变的纯合患者的iPS细胞系，这是家族性PD最常见
19、的原因17。Seibler等最近也获得了由于PINK1基因突变引起的家族性帕金森症患者的iPS细胞系18，他们发现病人iPS细胞诱导的多巴胺神经元表现出线粒体功能障碍，而引入外源PINK1可以减轻这种障碍，提示突变的PINK1是通过损伤线粒体功能的方式引起多巴胺神经元凋亡。利用该疾病模型不仅归纳了PD的主要病理学特征，还能进一步对该病的分子机制进行研究，并发现有效的治疗干预方式，是iPS用于建立疾病模型的又一重大进展。4.家族性植物神经障碍(Familial dysautonomia, FD)FD是一种几乎是东欧犹太人独有的常染色体隐性遗传病，在该种族发病率约为1/3600。FD表现为感觉和自
20、主神经病变，主要症状有进食困难，泪缺乏，无代偿性心率加快的直立性低血压，疼痛感和温度感下降。FD常常是致命的，即使接受最好的治疗也只有一半病人可以活到成年19。FD大多是由于IKBKAP基因（又名ELP1基因，该基因编码产物能参与形成转录延伸复合体）发生点突变，引起基因发生部分错误剪接引起20，导致一些编码保持细胞活性必须的蛋白质的靶基因转录减少21。近年的研究中，Lee等22从3名FD患者身上获得iPS细胞（FD-iPS），然后将这些细胞诱导分化，构建了FD体外模型。作者发现，这些由FD-iPS细胞分化的神经细胞并不像培养皿中的正常细胞一样容易迁移，且FD-iPS细胞分化而来的神经管嵴前体细
21、胞（neural crest precursor cell）内IKBKAP基因转录水平比其它组织细胞中的低得多。此外，他们还发现激动素（kinetin）能够明显改善IKBKAP基因的剪接过程，进一步治疗还可促进神经细胞分化，部分改善了神经缺陷，但仍不能影响其迁移能力，使之完全恢复正常。尽管如此，这项发现仍为人们更进一步了解FD的分子机制提供了有用信息，也证明了由病人iPS细胞诱导来的细胞模型在药物发现和选择上的作用。5.Rett综合征（Rett syndrome）Rett综合征是一种X连锁的神经发育遗传病，常在6-18个月时发育停滞，继而发生发育退化，肌张力减退，癫痫和自闭症行为等。该病主要累
22、及女性，发病率为1/10,0001/15,000。Rett综合征是由于甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）基因突变引起，这种蛋白质涉及众多基因的表观遗传和转录调节23,24。近年来，Marchetto等建立了4名女性Rett综合征患者的iPS细胞系，然后将其分化为神经元，并与正常人分化而来的神经元进行对比25，发现两者在神经发生过程中并无差异，只是Rett患者的成熟神经元比正常的小一些，树突棘和谷氨酰胺兴奋性突触也较少。值得注意的是，此表型可以通过表达或抑制MeCP2基因来调控，说明该基因是决定神经元中谷氨酰胺能突触数量的因素之一。Rett患者的iPS细胞也显示钙流动和自发性突触后电流的减少，
23、说明了神经元之间的联系性减弱。最近他们又利用Rett患者的iPS细胞研究MeCP2基因在调控长散布重复序列（long interspersed nuclear elements，LINE）中的作用，这项研究成为利用患者iPS细胞作为疾病模型来研究疾病机制的又一成果26。6.神经精神疾病精神分裂症（Schizophrenia）是一种严重的长期性精神性疾病，主要表现有妄想，缺乏积极性，语言能力和社交能力下降等。本病常发生在青春期，对病人，家庭和社会都造成了巨大的负担。精神分裂症的病因非常复杂，除了环境，遗传也是一个重要因素。与其他精神性疾病一样，建立可靠的精神分裂症动物模型非常困难。近来的研究显示
24、，四名精神分裂症患者的iPS细胞被分化为神经元，这些神经元的突起密度，神经元联系性和谷氨酸受体的表达下降，cAMP和WNT信号通路的基因表达也都有所改变27。在经过3周的洛沙平（一种抗精神病药）治疗后，神经元联系性和基因表达异常得到改善。7.其他神经系统疾病随着对iPS细胞研究的深入，其他神经系统疾病患者来源的体细胞已经被成功诱导为iPS细胞。包括杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，也称杜氏肌肉萎缩症），亨廷顿氏舞蹈症（Huntington disease，HD），Angelman综合征（Angelman syndrome）和普拉德-威利综合征（Prade
25、r-Willi syndrome）等。其中，有一些发现令人瞩目。例如，由Angelman综合征和普拉德-威利综合征患者体细胞诱导来的iPS细胞因为15号染色体特定片段表达缺失导致神经发育障碍，这种基因缺陷受到父母的原始基因影响，在重编程后仍保持DNA甲基化的印记28,29，iPS技术在认识这类与基因印记相关的疾病上面显现出了极大的优势。最近，Kazuki研究小组30纠正了一名杜氏肌肉萎缩症患者成纤维细胞的基因异常，其肌萎缩蛋白基因的4-43号外显子缺失，他们用具有完整肌萎缩蛋白序列的人工染色体进行替换了这段部分缺失的基因。由于肌萎缩蛋白基因是一段较长的基因，这种基因替换治疗非常有难度，尤其是对
26、于基因缺失较多的患者，所以这种治疗方式应用与临床还存在很多的问题。但不可否认的是，作者的研究组成功将纠正的成纤维细胞诱导为iPS细胞，显示了基因治疗与iPS技术相结合的巨大发展潜力，具有重要的意义，人们离个性化医疗的时代更近了一步。四、 应用iPS细胞面临的问题尽管应用iPS技术建立疾病模型的研究飞速发展，但这种方法仍是刚刚起步。许多神经系统变性疾病是由于特定基因突变引起，这类疾病可利用患者的体细胞诱导iPS细胞，进而定向分化，建立疾病模型用于研究发病机制及药物干预。然而，大多数疾病的发病不仅与遗传有关，还与环境和年龄等因素相关，而如何给iPS细胞一定的环境刺激还需进一步研究。除此之外，一些疾
27、病的发病原因与不止一种细胞有关，如ALS，主要是由于SOD1基因突变引起运动神经元变性所致。Giorgio等31的研究指出，用含SOD1突变基因的神经胶质细胞与正常的运动神经元共培养也会引起运动神经元的变性，说明神经胶质细胞对运动神经元生存、变性有直接作用，因而仅用病变细胞研究发病机制是不全面的。还有一个问题是iPS细胞分化的细胞和组织的“年龄” 32。通常的iPS技术所诱导出的细胞比较幼稚，表现出一些胎儿细胞的特征，功能也不完全成熟，而有很多疾病的发病年龄都比较晚，要在体外构建出“高龄”细胞就需要一些新的技术，例如自由基刺激（free radical exposure）、环境毒物（envir
28、onmental toxins）刺激、或者胞内过表达一些能够促使毒物聚集的蛋白质等等，但还需要进一步研究。 iPS细胞不仅可用于研究发病机制，有效药物等，还可用于细胞移植治疗某些神经系统疾病。在临床应用方面，也有几个重要的问题。其中，安全性是首要问题。在诱导iPS的过程中，病毒的基因整合可能会激活原癌基因，导致肿瘤产生。此外，移植入重编程不完全的细胞或是某些细胞已沉默的基因被重新激活，细胞重新获得多能性都会导致畸胎瘤的形成。体细胞重编程成本高，效率低也是临床推广的巨大障碍。五、 总结与展望iPS的出现不仅是再生医学的里程碑，对于基础医学的研究也起到了莫大的推动作用。人们通过构建神经系统疾病模型
29、对许多常见神经系统疾病的机制进行了进一步研究，为临床治疗和药物选择都提供了大量依据。iPS模型可以解决许多小鼠模型不能解决的问题，比如一些疾病无法用小鼠模型来真实地加以复制。FD小鼠模型就是一个很好的例子，因为缺乏IKBKAP蛋白的小鼠胚胎在发育早期就会死亡， FD-iPS细胞模型就成为了唯一的希望。不过iPS细胞模型并不能完全取代动物模型，没有合适的动物模型，就很难验证通过iPS细胞模型得到的结果。只有两种疾病模型有机结合人们才能更好地认识疾病。在临床应用方面，iPS细胞的出现解决了干细胞移植最大的障碍。具体到神经系统疾病，iPS细胞的出现使其治疗手段更加多样化。脑出血等损伤性疾病将不再单纯
30、依赖康复训练，遗传性疾病也将可以通过神经细胞移植得到有效治疗，这正是iPS细胞最为可贵之处。iPS细胞技术仍然在不断发展，我们有理由相信，未来人们可以通过它来获取患者完整的遗传信息，制备出患者个人的组织器官，还可以在用药前先对药物进行筛选和检测，甚至预测某项预防措施的效果。iPS细胞技术最终必将成为临床上的一项常规技术，展现出强大的生命力。参考文献1. Yamasaki T R, Blurton-Jones M, Morrissette D A, et al. Neural stem cells improve memory in an inducible mouse model of neu
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