《2745.土壤中分解纤维细菌的分离与性质鉴定.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2745.土壤中分解纤维细菌的分离与性质鉴定.doc（8页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、土壤中分解纤维细菌的分离与性质鉴定 摘 要：根据纤维分解菌对滤纸崩解的作用，利用土粒法从土壤中分离得到好气性纤维素分解菌，对其进行了一系列形态及生理生化特征的检测，初步确定是属于纤维粘菌属,并用气相色谱仪鉴定其代谢产物中高级脂肪酸的变化,表明此菌只产生极微量的HFA,分别为棕闾酸,油酸,亚油酸。最后通过滤纸崩解试验进一步验证并粗略比较该菌对纤维素的分解能力。关键词：纤维素细菌分离鉴定气相色谱仪The sepaiating and charater identifying of the fiber decomposing germ in soilAbstract:According to the
2、 function of the fiber decomposing germ on the filter paper,We separate one of the fiber decomposing germ by the method of soil particle. Making a series of examining about its patten. Physiology and biochemistry,and preliminarily defining ite category.We have also appraised the change of the HFA in
3、 its metabolizing outcome by FID. Finally wi test and verify its ability of fiber decomposing by the method of filter paper resolving.Key words: fiber decomposing germ separate identify FID 引 言：在自然界中存在着可以分解纤维素的微生物，它们包括：真菌、细菌、放线菌，研究纤维素生物转化具有重要意义，我国是一个饲料资源十分紧缺的国家，通过微生物发酵充分利用农副产品下脚料、桔杆等提高饲料利用率，改善粗饲料的营养
4、价值，降低成本，具有广阔的开发前景。此外，在生物制浆、处理造纸厂废水的环境污染，取新型能源方面，也有很高的价值，过去的几十年中在转化纤维素为饲料和酒精上做了很多工作，特别是近年来，人们利用热纤梭菌（clostridium ther mocellum）直接分解或与其它细菌共同培养分解纤维素产生酒精，进行了广泛研究，但对土壤中好气性纤维素分解菌的报道极少，在医疗，获取纤维素酶制剂方面，好气性纤维素分解菌似乎更具优势。故在此方面有进行探讨的必要。一、材料与方法（一）实验主要材料：1、杨凌地区六个不同点土样2、增菌培养基（GN换用方）：胰蛋白胨 葡萄糖 甘露醇 柠檬酸钠 磷酸氢二钾 氯化钠 蒸馏水3、
5、营养肉汤：蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水4、糖发酵培养基：蛋白胨 氯化钠 牛肉膏 琼脂 澳甲酚紫（在上述基础培养基中，加入所需糖类即可）5、 赫奇逊培养基：KH2PO4 MgSO47H2O NaNO3 FeCl3 CaCl 琼脂（二）实验设计实验中通过优势择菌法从土壤样品中选择具有较强纤维素分解能力的优势菌，再进一步培养，经划线分离得到单个纯的菌后，对其进行进一步的生化鉴定如：革兰氏染色镜检、糖发酵的测定，三竣酸循环产物的测定等。将其初步归入特定菌属，最后经试纸崩解实验验证其分纤维素的分解能力，并与其它试验者的试验菌比较中间纤维素分解能力的强弱。（三）测定方法1、土样采集：要求具有一定代表性和
6、均一性。分别在建筑工地、玉米秆堆下、玉米地、柏树林、烟草地、麦秸堆下六个不同地点以对角线三点取样法取样。先将表层03m上刮去，取上工具在采样点旁土壤中擦试数次，各点取样约0.51kg，放在预先准备好的灭菌报纸上进行充分混合，用四分法留0.51kg，装入灭菌土袋，记录土壤名称、地点、采样时间等。2、优势菌的选取：利用土粒法进行好气性纤维素分解菌的选取。（1）制平板：取已溶化并保温在50下的赫奇逊琼脂培养基1支，以无菌操作法倒入无菌皿中，冷凝成平板。（2）加滤纸：用无菌镊子夹取灭菌的滤纸一张，平铺在平板上，用无菌刮铲展平使紧贴于培养基表面，再滴加无菌水少许，使滤纸湿润。（3）接种培养：用无菌镊子又
7、处理好的土样点接于滤纸上，将皿正放于27下保温保养。（4）好气性纤维素的选取：接种培养7d后，选取滤纸呈腐烂处用解剖针挑取菌落涂于灭菌后的营养琼脂培养基上27培养1d。3、单个菌落的获得：从营养琼脂平板上将形态不一致的菌落再分别划线，直到菌落形态一致。4、菌微生物学性质的测定（1）形态描述水洗涂 片干燥加热固定冷却结晶紫初染碘液媒染水洗酒精脱色水洗番红复染水洗干燥镜检（2）革兰氏染色：（3）糖发酵试验：用灭菌过的注射器吸取2ml灭过菌的糖发酵液封端后，注入菌液，置于保温和相中培养，定期观察记录。（4）脂肪酸的测定：取培养1d后的营养肉汤菌液，用气相色谱器检测脂肪酸含量。5、纤维素分解能力的检测
8、（1）先将接种于营养肉汤复苏,然后用稀释培养法计数,接种1ml于含有1*4cm中速滤纸的10ml肉汤中28继续培养,每隔硫小时继续观差滤纸得分解情况。（2）取同（1）中的菌液进行稀释计数。二、结果与分析（一）培养2d后，不同土样中微生物对滤纸的分解强弱土 样分解程度（越多，分解越彻底）建筑工地生上玉米秆堆下土玉米地柏树林烟草地从表中可以看出，秸杆地含好气相性纤维素分解菌较多，而建筑工地类含所需分解纤维较小的地方，几乎没有好气性纤维类分解菌。（二）不同土样中分离得到的菌1、所有土样中均得到两种不同形态的菌落2、菌落描述菌落形状边缘色泽湿润凹凸色素a圆整齐黄色湿润低凸面黄色不扩散色素c圆整齐乳白扩
9、展3、菌落理化性质（1）革兰氏染色镜鉴菌革兰染色形 态aG+单个椭圆形，偶有成链状cG+棒状，成链状，不分枝（2）糖类发酵试验（只对C菌）糖发酵液结果产酸产气泡蔗糖阴性葡萄糖阴性甘露糖阴性（3）代谢产物中脂肪酸的检测本实验所用的检测器为FID，检测条件如下：色谱柱：2m3mm玻璃柱固定液：6%DEGS（聚二乙二醇丁二酸酯）担 体：101白色担体（酸洗，60-80目）担 温：195汽化室：检测皿温度 250载 气：N2（40ml/min）H2 1.4kg/cm2 空气 1.2kg/cm2进样量：2l样品处理:在10ml培养液中加入3ml石油醚萃取,振荡静置30min,分层后用吸管吸去下层水相,上
10、层进行甲酯化处理.数据处理及结果:以已知菜油样为标样,对样品中未知峰定性,以峰面积之比定量,峰积分由Easy2000工作站自动执行.50mg菜油标样气相色谱图50mg菜油标样气相色普图营养肉汤检测图C菌代谢物检测图由图可知：C菌培养一天后，脂肪酸的气相色谱图明显比空白对照多出3个峰，对比菜油标准图谱可知，三者分别是：棕榈酸、油酸、亚油酸、即C菌代谢产物中所含脂肪酸。通过与已知菜油标样峰面积比较得知:10ml营养肉汤中约含有相当于12.5mg菜油中HFA含量. （4）由上述理化性质鉴定的结果可粗步将C菌划分到纤维粘菌属。4、滤纸崩解试验滤纸崩解前后对比（1）滤纸崩解试验结果记录:从滤纸崩解试验结
11、果图中，可见培养一天后，滤纸片已变为肉眼可见的纵纤维样，轻轻摇动试管，滤纸完全消失。由此可见，C菌确实是纤维素分解菌，且具有较强的纤维素分解能力。（2）计数：C-9C-10原菌液中（单位：个/ml）392298三、讨论（一）除建筑工地外，利用土粒法，从样品土壤中获得好气性纤维素分解菌，可见土壤由于具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗碱度、渗透压和温度等条件，确定是微生物的“大本营”。土粒法筛选好气性纤维素分解菌具有极大的简易性、可靠性。分离到的C菌是好气性的革兰氏阳性细菌，不产色素，可利用葡萄糖、蔗糖或甘露糖作为碳源，同时也可利用纤维素作为唯一碳源生长。参照文献6，将其
12、初步纳入纤维粘菌属，如须进一步细致检测，则还应对该菌的其它微生物学特征进行深入实验。如：最适生长PH值，最适生长温度，生活日期，甚至是其基因的检测。（二）纤维素的分解试验通过滤纸崩解实验来检测菌株对纤维素的分解能力，重复3次，均得到明显效果。放入营养肉汤中的滤纸条在24小时内基本上降解完全，该菌具有较强的纤维素分解能力。所以用纤维素作为碳源，根据是否水解滤纸进行初步筛选产纤维素酶的细菌的方法是可靠的。但仅以水解滤纸的速度作为纤维素分解能力的定量指标是不够的，其原因是多方面的。如固体和液体培养条件不同，菌所处生理状态也各有差异7，此外，不同菌所产生的纤维素酶的最适反应条件也各不尽相同等等，这些都
13、有可能影响菌对纤维素的分解。同时，还应注意到纤维分解后产物的性质也是影响到该菌能否应用于生产的一定重要因素，如产物中有部分毒害气体的产生8，则决定了它将不被利用，此外，还应注意多种菌的相互的协调作用。（三）脂肪酸的测定从气相色谱图中可以看出培养24小时后的菌培养液中较空白对照明显多出3个峰，分别是：称榈酸，油酸及亚油酸，这就给我们生产中利用该菌与其它菌协调作用时提供了一个代谢产物的指标。本次实验仅仅检测到了代谢物中脂肪酸的含量，但却证明了气相色谱技术在微生物学中的广泛用途，除脂肪酸外，代谢产生的糖类物质、分解纤维素后产生的气相等均可用气相色谱仅进行检测。（四）糖发酵实验法的新尝试此次实验中创造
14、性的运用改良过的注射皿来进行糖发酵实验，与传统方法相比9，该法解决了杜氏管中只能收集到部分菌产生的气体这一缺陷，同时更能精确的测量产生气体的体积，此外，杜氏管更适用于好气性菌的糖发酵检测，而改变注射器法则可以适用于任意菌种，且还能鉴定出严格的好气性菌，但此法也存在一些不足，如用于严格的好气性菌时，由于需在反应前注入一定量的空气，这就给操作上带来了不便之处，且容易影响气体体积测量的精确度，总的来看，此法仍是较传统方法更具准确性，有待进一步改进。总之，纤维素分解菌的分离在生产、生活中具极大的意义，从70年代以来，随着矿物能源的日趋枯渴和环境污染越来越严重，利用纤维素分解菌来开辟新能源和防止纤维素底
15、物的污染已成为越来越多人关注的热点，另外，在改善动物饲料营养成分开展生产待用纸张的微生物腐蚀方面的研究，纤维素酶制剂的提取等方面也具一定的现实意义。参考文献：1沈雪亮，夏黎明.产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究.林产化学与工业，2002年3月第22卷第1期2郭爱莲，阮黎.产纤维素酶细菌 -01的研究.西北林学院学报，1997年12（2）：46-513杨雪欣，张立惠，徐忠.大豆秸秆纤为素菌水解条件的研究.哈尔滨商业大学学报（自然科学报）2003年12月第19卷第6期4彭海宏.新型瘤胃纤维分解细菌Clostridium chartatabidum导入绵羊瘤胃后存活监测及其对纤维素消化率的影响草草食
16、家畜（季刊）1998年3月第1期5王炜，付建红.一株产纤维素酶细菌液体发酵条件的初步研究.新疆农业科学，2001，38（4）：20-226李家明，赵海.一株极端嗜热厌氧纤维素分解细菌的分离和生理性状研究.太阳能学报，1994年10月，第15卷第4期7王宜磊，孙迅.五株降解半纤维素细菌的分离鉴定与酶活检测.山东师大学报（自然科学版），1997年12月第12卷第4期8周红，杨祥良.半纤维素菌株发酵液中单糖及二糖的分析.武汉化工学院学报，2002年12月，第24卷第4期9孙迅，王宜磊. 四株降解纤维素细菌的分离鉴定.四菏泽师专学报，1997年5月第19卷第2期10王淑军，杨从发.固态降解农作物秸秆纤
17、维素菌株分离筛选方法的研究.淮淮海工学院食品工程系，1999年3月11DevereuxR,Willis S G.Amplification of ribosomal RNA sequences:Molecular Ecology Manual. Netherland:Kluwer Academic Publisbers,1995,3.3.1112Madden R H. Int J Syst Baceriol, 1983,33:837-84013Jin F, Yamasato K, Toda K, Int J Syst Bacteriol ,1988,38:279-28114Fardiau M L,Ollivier B, Carcia J L, et al .Int J Syst Eoolu Bacteriol ,2001,51:1127-113115Madenovska Z, Mathrani I M,Ahring B. Arch Microbiol,1995,163:223-230致 谢感谢我的指导老师 的悉心指导，感谢搭档 同学的配合！正是由于他们的帮助，我的工作才得以顺利完成。
