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1、毕 业 论 文（设计）题 目ELISA法检测水产品中氯霉素的残留量指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年5月30日摘 要采用酶联免疫吸附试验法对4个水产样品氯霉素的残留量进行检测，判断其是否符合国标限量要求，以便为其进入市场提供监测依据。研究主要利用溶剂萃取技术对样品进行预处理，再利用酶联免疫吸附试验法(ELISA法)测定样品中残留氯霉素含量；检测结果表明，4个水产样品（花莲、鲈鱼、甲鱼、南美白对虾）中氯霉素含量依次为0.011、0.011、0.014、0.009 ug/kg，均低于国标限量值0.3ug/kg，符合动物源性食品出口欧盟和美国等国家的要求，可以进入
2、市场。关键词：ELISA法；水产品；氯霉素；残留量目 录引言11 材料与仪器21.1 实验样品21.2 实验试剂21.3 试验仪器22 方法32.1 样品预处理32.2 酶联免疫检测33 结果与分析43.1 标准曲线的制作43.2 样品中氯霉素浓度测定53.3 加标回收率实验64 总结与讨论7参考文献8引言酶联免疫吸附试验（以下简称ELISA），是酶免疫测定技术中应用最广的技术1。自从EngvaLL和PerLman（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Lmmunos orbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、易于标准化等优点，使其
3、得到迅速的发展和广泛的应用。基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体在固相表面进行反应，用洗涤法将液相中的游离成分洗除2。ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗原分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过酶联免疫检测仪（酶标仪）进行定量测定，这
4、样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。根据ELISA所用的固相载体ELISA方法可分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维素膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质的不同分为间接ELISA、双抗夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA3。本次试验所要用到的是竞争性酶联
5、免疫吸附试验（即竞争ELISA），ELISA测定的基础是竟争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行4。当加入氯霉素酶标记物、标准或样液、抗体(兔IgG即兔抗氯霉素的抗体)后，存在于样品或标准溶液中的游离氯霉素和酶标记氯霉素相互竞争与氯霉素特异性抗体的结合位点。由于微孔板中已包被有羊抗兔IgG的抗体，所以氯霉素抗体与羊抗体相结合而被固相化在微孔中，与氯霉素抗体结合的氯霉素酶标记物也因此被保留在微孔中，没有被结合的氯霉素酶标记物和未固相化的物质在洗涤步骤中被去除。之后将底物溶液加入微孔中孵育,氯霉素酶标记物中的酶通过与底物反应，将无色的底物催化为蓝色的产物,加入反应终止液可使颜色由蓝
6、变黄。用酶联免疫检测仪（酶标仪）在450nm处测量吸光度值，样品中氯霉素浓度与吸光度值成反比。氯霉素(ChLoramphenicoL,简称CAP)，又称氯胺苯醇,是一种广谱抗生素5。由于其价廉及优良的抗菌性、稳定的药性，曾在一段时间内作为饲料添加剂和细菌性疾病的治疗用药，特别是在水产品中，使用范围较广6。但氯霉素对骨髓造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血，腹胀、腹泻、食欲减退，口腔粘膜充血、疼痛、糜烂、口角炎和舌炎等。另外还可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。因此，动物源性食品中氯霉素的残留受到世界各国和地区的高度重视。欧盟、美国
7、、加拿大等国家禁止在食用动物中使用氯霉素，欧盟规定进口食品中氯霉素不得检出，方法检出限要求为0.3ug/kg7。目前公布的氯霉素检测技术方法有微生物法、放射免疫法、气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、质谱分析等8,这些方法各有优劣。酶联免疫法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高，样品预处理简单等优点，且不需要复杂的仪器设备，能在短短的几小时内检测几十个到上百个样品，非常适合大批量样品的检测工作9。酶联免疫检测法(ELISA)又称酶标法。本实验采用竞争ELISA法对鱼、虾类水产品中的氯霉素的残留量进行了测定。1材料与仪器1.1实验样品花莲（编号为1号样品）；鲈鱼（编号为2号样品）；甲鱼（
8、编号为3号样品）；南美白对虾（编号为4号样品）。备注：以上样品均已剪碎并用匀浆机匀浆，放在冰箱冷冻室冷冻保存。1.2实验试剂氯霉素检测试剂盒（荷兰EURO-DIA GNOSTICN公司），乙酸乙酯(AR)，正己烷（AR）；其中检测试剂盒包括：128孔板，包被有抗兔IgG的羊抗体；6瓶氯霉素标准浓缩液1mL；酶结合物溶液(CAP-HRPO)；氯霉素抗体浓缩液(Anti-CAP)；零标准缓冲液（zero standard buffer）；洗涤缓冲液（Rinsing buffer）；底物溶液（Substrate solution）；样品稀释缓冲液。1.3实验仪器离心机（80-2，金坛市恒丰仪器制造有
9、限公司）；分析天平（PL202-S，上海优浦科学仪器有限公司）；微型漩涡混合仪（VX200Labnet，上海天呈生物医学）；氮吹仪（N- EVAP111，美国Organomation公司）5；酶联免疫检测仪（酶标仪，550，北京利康达圣科技发展有限公司）；移液抢（NX16-0.2-2uL，美国Labnet）。2 方法2.1样品预处理样品解冻：将放在冰箱冷冻室的样品取出，室温下解冻。样品提取：精确称取3.0g经解冻后的样品至10mL具塞玻璃离心管中加入6mL乙酸乙酯，均质3min放置3060min混匀，2000r/min离心10min用移液抢移取2mL上清液至10mL玻璃试管中用氮气在50水浴中
10、吹干。加入1mL正己烷溶解脂肪、色素等杂质加入1mL样品稀释缓冲溶液（使用前需用蒸馏水稀释4倍）快速、充分振荡混匀2000r/min离心4min（若发生乳化现象，需将试管放置于80水浴中5min，然后再离心）取下层水相溶液于塑料小离心管内，用于检测分析。2.2酶联免疫检测试剂盒回温：使用之前应先将试剂盒及盒内所有试剂恢复至室温2025（提前30分钟从冰箱取出即可）。试剂准备：将冻干品（又称氯霉素酶结合物CAP-HRPO）和氯霉素抗体浓缩液(Anti-CAP)分别加入4mL零标准缓冲液充分溶解6，备用。上板：在微孔板中按顺序依次加入100uL零标准缓冲液（zero standard buffer
11、，作为空白对照）50uL标准浓缩溶液（2，0.5，0.2，0.1，0.05，0.025ng/mL和零标准溶液）50uL处理好的样品溶液再在上诉各孔中依次加入25uL稀释了的酶结合物溶液25uL稀释了的抗体溶液摇板1min封板，4下在暗处温育1小时。洗板：将微孔板上端朝下倒空各孔后，再平稳快速向下垂直甩动，并将微孔架倒置在吸水纸上拍打以除去孔中的液体，吸取洗涤缓冲液（Rinsing buffer，20倍浓缩，用前需用水稀释20倍）250uL/孔注入全部板孔，再次倒掉微孔中的液体。重复上述操作3遍。注意一定要把孔中的液体拍干，若孔中有气泡用枪头捅破。将100uL底物溶液（Substrate sol
12、ution，即时可用）加入各孔，室温（25）暗处温育30min。最后将100uL终止液（Stop solution，即时可用）加入各孔，混匀后，在10min内用酶标仪在450nm处测量吸光度值。3 结果与分析3.1标准曲线的制作采用酶标仪测定吸光度值，测定结果是450nm处吸光度最大。以标准溶液0.000（零标准）、2.000、0.500、0.200、0.100、0.050、和0.025ng/mL各50uL，标样的孔中均依次加入25uL酶结合的氯霉素(ACP-HRPO)和25uL氯霉素抗体溶液(ANTI-CAP)，以100uL零标准缓冲液作为空白试样进行对照实验。重复测定2次。以标准溶液(包括
13、零标准A0)扣除空白后的吸光度A作为测定结果10，如表3.1所示。表3.1 氯霉素检测标准曲线折算对应测定值表StandAbsorbance 1Absorbance 2Mean abs(abs-bLanc)% maxConc（ng/mL）02.0862.1742.088100.020.3480.3550.31014.81.750.50.6790.6900.64330.80.540.20.8910.9720.89042.60.230.11.1531.1491.10953.10.110.051.3451.4111.33664.00.050.0251.5801.6021.54974.20.02bLa
14、nc0.0400.044以氯霉素平均浓度的对数值为横坐标（X），标准溶液吸光度与零标准溶液吸光度的百分比值(A/A0)为纵坐标（Y），由计算机系统回归统计制得标准曲线如图3.1所示。图3.1 标准曲线由图3.1及计算机回归所得在0.0252.000ng/mL范围内，样品中氯霉素含量（x,ng/mL）与吸光度之比（y=A/A0,%）的关系曲线为：Y=-13.653Ln(X)+22.467相关系数R=0.9954。3.2样品中氯霉素浓度的测定在制作标准曲线的同时，吸取花莲（1号样品），鲈鱼（2号样品），甲鱼（3号样品），南美白对虾（4号样品）的样品提取液各50uL做同步实验，各孔中均依次加入25u
15、LCAP-HRPO和25uLANTI-CAP，以100uL零标准缓冲液作为空白对照。重复进行2次实验，根据方程Y=-13.653Ln(X)+22.467计算得到试样溶液和原待测样品中氯霉素含量，结果见表3.2。表3.2 样品中氯霉素含量检测结果编号检测样品氯霉素检测含量(ng/mL)平均检测含量国标限量12ng/mLug/kg0.3(ug/kg)1花莲0.0090.0120.01050.0112鲈鱼0.0120.0100.0110.0113甲鱼0.0140.0130.01350.0144南美白对虾0.0090.0090.0090.009由表3.2可以看出，1号样品花莲检测出的氯霉素浓度为0.0
16、11ug/kg，2号样品鲈鱼检测出氯霉素的浓度为0.011ug/kg，3号样品甲鱼检测出的氯霉素浓度为0.014ug/kg，4号样品南美白对虾检测出的氯霉素浓度为0.009ug/kg。检测结果表明，4个所测试的水产样品（花莲，鲈鱼，甲鱼，南美白对虾）中氯霉素含量均低于国标限量值0.3ug/kg，符合动物源性食品出口欧盟和美国等国家的要求，可以安全进入市场。3.3加样回收率实验将4号样品南美白对虾准确称取3.0g于10mL玻璃试管中，共3份，分别加入氯霉素标准液(10ng/mL)120.0uL，加入6.0mL乙酸乙酯，在通风橱内混合10min。按2.1进行样品预处理，然后按照2.2进行上板检测。
17、计算加标回收率，实验结果如表3.3所示。表3.3 氯霉素加样回收率检测结果原样测定值（ng/mL）添加量（ng/mL）测定值（ng/mL）回收率%0.0090.40.37892.30.0090.40.37290.00.0090.40.38493.8从表3.3可见，氯霉素的加样回收率在90.0%93.8%之间，平均值为92.0%，可见在实验过程中氯霉素的损失量较少。4 总结与讨论利用酶联免疫吸附试验法（ELISA法）检测动物组织中氯霉素的残留量。ELISA是酶标记的抗原与抗体进行的抗原-抗体反应。由于酶的专一性催化作用，微孔板上多份样品同时检测，故操作简单，灵敏度、精密度较高。本实验的方法检出限
18、为0.3ug/kg，回收率在90.0%93.8%之间，平均值为92.0%。且在0.0252.00 ng/mL测量范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.9954。氯霉素含量(X,ng/mL)与吸光度之比（Y=A/A0,%）的线性方程为Y=-13.653Ln(X)+22.467。结果表明，采用酶联免疫法测定，不仅检测限达到ng级，而且回收率、精密度都能满足要求国际标准，尤其是操作简单，检测时间短（仅需2h），所以非常适合大批量样品的筛选检测。但考虑到酶联免疫法检测的影响因素较多，易出现假阳性结果，最好采用本法筛选，阳性样品再用GC-MS联用技术或HPLC确证，则可获得更加准确的检出结果10。随着国
19、际健康组织对氯霉素的严格控制，尤其是日本肯定列表制度的出台更是大大提高了世界各国对违禁药物的重视。我国也实行了氯霉素零检出量的规定。因此，建立氯霉素的快速有效的检测方法，制止此药物的非法滥用，保障人民的健康和生命安全，维护我国在国际贸易中的形象和地位意义重大。参考文献1朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法M.北京：人民军医出版社，2000,356-357.2柳爱春,李锋,余霞奎等.水产品中氯霉素检测方法的比较与分析J.安徽农学通报,2009,15(16):36-38.3张小平,张明洲,陈宗伦等.动物组织中氯霉素残留快速检测方法研究J.安徽农学通报,2008,14(23):88-91.4田文礼,彭
20、文君,韩胜明等.液相色谱-串联三重四极杆质谱测定蜂蜜中的氯霉素残留J.食品科学,2009,30(14):285-287.5田素娟,董斌,袁茵等.氯霉素竞争ELISA检测方法的研究J.中国预防兽医学报,2009,31(7):545-548.6张胜帮,董士华,刘继东等.酶联免疫检测法测定水产品中残留氯霉素的研究J.中国食品学报,2006,8(2):41-43.7GB/T22338-2008,动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定S.8黄冬梅,蔡友琼,毕士川等.酶联免疫(ELISA)法测定水产品中氯霉素残留量J.福建水产,2004,12(4):20-23.9陈国志.酶联免疫法检测食品中氯霉素J.中国热带医学,2004,4(2):4-6.10,张晓辉.酶联免疫吸附试验(ELISA)在水产品药物残留检测中存在的问题及对策J.河北渔业,2007,34(5):972-973.
