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1、D-二聚体检测的方法及其临床应用上海第二医科大学附属瑞金医院检验医学系胡翊群 王鸿利 D-二聚体（D-Dimer,D-D）是交朕纤维蛋白（Fb）特异的降解产物，它的生成或增高反映了凝血和纤溶系统的激活。在全血或血浆中，采用针对D-D的抗体可以很容易地检测D-D含量。近10年来，已建立了多种有价值的D-D的检测方法。早在80年代末90年代初期，人们发现D-D对临床上疑诊为静脉血栓形成（venous thrombo-embolism，VTE）的患者高度敏感，但不特异。在这些患者中，当血浆D-D浓度低于：某一临界值（通常为500g/l）时，其阴性预测值大于90%，由此可以作为排除VTE的筛选试验。近
2、年来，随着方法学的不断进步，建立多种适用于急诊的简单快速的敏感方法，D-D检测的临床应用越来越广泛。大量研究已经亢分证实了D-D在排除诊断下肢深静脉血栓形成（deepvein thromboembolism，DVT）和肺栓塞（pulmonary embolism，PE）中的应用价值，已将其作为首选筛选指标之一。最近，D-D检测的应用巳深入到弥散性血管内凝血（DlC）、心血管疾病、激素替代治疗、恶性肿瘤以及抗凝治疗领域。一、D-D的生成 在各种病理和生理状态下，凝血系统的激活导致Fb的生成，而Fb的生成又可激活纤溶系统，引起纤溶酶（plasmin，PL）的生成和Fb的降解。在交联Fb的降解过程中
3、，生成了一系列的特异降解产物，其中包括D-D（D-Dimer）（图1A，1B）。 凝血系统的激活导致凝血酶生成，凝血酶结合于纤维蛋白原的中央结构域，释放纤维蛋白肽A（FPA）和纤维蛋白肽B（FPB），生成纤维蛋白单体和多聚体。在活化FXIII的作用下，生成交联的纤维蛋白。纤溶酶降解交联纤维蛋白，生成多种交联的纤维蛋白降解产物（FbDPs），其中包括D-D和其它的片段。二、D-D的检测方法 D-D的检测方法有多种，主要是基于胶乳凝集原理的定性或半定量试验以及基于ELISA原理的定量测定，也有些方法采用免疫浊度原理或免疫荧光原理。胶乳法灵敏度较低，而经典ELISA法操作费时，都不适合急诊使用。现在
4、已经发展了数种快速的、叮检测单份标本的高灵敏度检测方法。其中应用最广泛、得到临床研究认可的快速检测方法主要有两种：一种是在全血小进行的，只需2分钟就可得到定性结果的试验（自身红细胞凝集，SimpliRed, Agen；金标法Simplify，Agen）；另一种是快速ELISA（VIDASD-D，Biomerieux）。两种快速D-D检测方法与经典检测方法的比较见表1。其他一些快速检测法，无论是基于ELISA原理或是胶乳凝集原理，在推荐用于诊断可疑VTE或其他血栓性疾病前，应进行全面的临床应用评估。 对于用于排除诊断VTE的D-D检测方法而言，下列几个指标非常重要：敏感性；特异性；阴性预测值（N
5、PV）：即当D-D水平低于临界值或为阴性时，患者确实不患VTE的可能性；阳性预测值（PPV）：即当D-D水平高于临界值或为阳性时，患者患VTE的可能性。其中D-D检测方法对VTE的敏感性和NPV是评价该方法至关重要的指标。以下简要介绍几种常用方法的原理和检测特性，比较各种方法的性能，并就目前在D-D检测方法学上的局限性作一分析。表1 经典与新型快速D-D检测方法的比较 单份标本检测 快速 定量 敏感性 特异性 胶乳法 纤典血浆胶乳法（classical late） + + - - + 全血胶乳法（SimpliRed/simplify） + + - - + ELISA 经典ELISA - - +
6、 + - 快速ELISA法（VIDAS D-D） + + + + - （一） 胶乳凝集法 1SimpliRed（Agen Diagnostics Limited，Australia）是目前应用最广泛，性能也得到公认的自身红细胞凝集D-D检测方法。采用分别针对D-D和纤细胞上表位的双抗体，当血中D-D水平升高时，抗原抗体结合的增多而导致红细胞凝集，2分钟内可以判断结果，为半定量的白体红细胞凝集试验。其优点是可在全血中检测，省去了离心制备血浆的麻烦。对VTE的敏感性和NPV分别为81%-89%和90%-94%。如果仅对近端DVT而言，SimpliRed的敏感性和NPV叫更高些，特异性和PPV分别为
7、48%和67%仍不失为一种有价值的筛选高危的近端DVT的方法。 2Liatest定量试验 可在20分钟内完成。临界值为500ng/ml时，其对VTE的敏感性和NPV分别为35%和96%。如果仅对近端DVT而言，其NPV可达100%。 Liatest 与经典ELISA法有很好的相关性（r=0.98）。（二） 快速ELISA法 1VIDAS DD（Biomerieux，France）是一种定量全自动ELISA法，在VIDAS免疫分析仪上进行。它将两步的免疫夹心法与最后的荧光检测结合起来。利用现成的单剂量试剂和分析仪中储存的校准系统，对单份样本进行检测。现成试剂由包被了鼠抗D-D单抗的固相移液装置和
8、一试剂条组成，后者包含了其他所需试剂：结合剂（碱性磷酸酶标记的鼠抗D-D单抗）、洗涤剂、样品稀释剂和底物。将200ul血浆吸入试剂条后，所有步骤由分析仪完成。除需将血样常规离心15分钟外，结果可在35分钟内得到。结果以纤维蛋白原等价单位表示，其检测上限为1000ug/1，下限为50ug/l，低于正常参考值下限（68-494ug/l）。对DVT的敏感性和NPV分别为96%99%和95%99%。VIDAS DD是目前研究最多的一种检测方法，敏感性很高，与经典ELISA法有很好的一致性，最有希望取代经典ELISA法而成为DVT诊断的首选筛选试验。 2Instant IA DD（Stago，Asnie
9、reFrance）定性方法，在多孔膜上进行，利用免疫滤过装置并采用两种互补单抗，也可对D-D进行半定量检测。当样本中D-D水平高于500ng/ml时，将有颜色显示，颜色的深浅与D-D水平成正比此时结果为阳性。低于300ng/ml时无颜色产生，为阴性。在300-500ng/ml 时，有一灰色带显现，结果为可疑。本试验可在10分钟内完成。敏感性和NPV分别为78%-84%和86%-90%，敏感性低于VIDASDD。因此，Instant IA DD的应用远不如VIDAS DD那样广泛，还需进一步的临床应用研究对其进行严格的评价。 3Nycocard D-dimer Nycomed本法在多孔薄膜上经免
10、疫过滤后，由单抗偶朕金抗体，后者的结合剂所产牛的红色强度由Nycocard显示，强度与血浆中D-D水平（500-8000ng/ml）成比例，可定量检测。几分钟内即可完成。敏感性和NPv在不同报道中差别较大，并且厂商和实验室的结果存在较大的差异。可能的原因是被研究的人群不同，如门诊患者以及近端DVT患者的比例等。然而，无论如何解释，这种实验室之间结果的不可重复性不可避免将影响其临床应用。 （三） 方法学的局限性 上述各种快速D-D检测方法的优点是明显的，但遗憾的是各种方法也存在不同程度的缺点。对于基于胶乳凝集原理的快速检测方法来讲，敏感度低是其最大的缺点，且由于具结果判断以阴性和阳性表示，无法通
11、过降低临界值水平束提高敏感件。但是作为排除诊断试验，保证100%的敏感性是全关重要的。研究表明，若不能保证100%的敏感性，将会带来偏差，并造成严重的后果：每降低2%的灵敏度，就会有1/1000的可疑PE患者死亡。另外由于结果需肉眼观察，不可避免地存在不同观察者之间的差异。这些都是临床医师和患者有所顾虑的问题。 对于快速ELISA检测方法而言，各种方法之间的标准化是一个难题。现已有多种快速ELISA法，每种又有多种商品化的试剂盒。这些试剂盒使用的抗体及其捕获的相应抗原不同标本稀释度、检测限度和孵育时间等也互不相同。在151例临床疑诊为PE的患者中，全面比较了4种ELISA检测方法，发现各种方法
12、中位数的变异系数（CV）从3.5%到17%不等，但各种方法间的CV值却相当相近（15%-20%）。这种较差的重复性至少可以部分解释各种ELISA方法间较小的相关性（回归系数约为0.60）。再者，个同方法所得到参考值差别也相当大，各种ELISA 方法之间很难标准化。但从另方面考虑，由于各种方法识别血浆或全血中的不同成分，并且采用了不同的技术，其结果的异质性是在预料之中的。所以，现在人们已经认识到，与其要求一种不大可能实现的标准化，还不如对每种方法根据以下四点进行临床应用评估，评估后制订出各自的严格的临界值。必要时，可通过降低临界值而保证100%的敏感性。D-D检测方法的四步评估包括：检测方法所用
13、的技术；与标准诊断方法作全面比较，确定新方法的严格临界值（采用Receiver Operating CharacteristicCurre，ROC曲线分析）以及相应的对确诊VTE的敏感性和特异性；“管理”实验，即D-D浓度低于临界值的患者，停服抗凝剂，随访三个月以观察其是否有迟后发病现象，由此判断新方法的真正诊断价值；比较新方法的价-效比。三、DD检测的临床意义D-D的生成反映机体凝血和纤溶系统的激活，在各种血栓形成性疾病以及牛理性高凝状态时均有升高。特别是对VTE高度敏感，在VTE的排除诊断中具有重要价值。另外，D-D在心血管疾病、DIC、恶性肿瘤等疾病叫，也有明显变化，足反映疾病的严重程度
14、、发展变化、以及疗效和顶后的有用指标。（一） 伴随有D-D升高的疾病1深静脉血栓形成（DVT）2肺栓塞（PE）3弥散性血管内凝血（DIC）4心血管疾病：急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化、高血压等5恶性肿瘤：乳腺癌、卵巢癌、急性臼血病等6手术、创伤后7溶栓治疗后8脑血管疾病9严重感染、脓毒血症、坏疽等10绝经后激素替代治疗、先兆子痫、妊娠11其他 甲减、慢性肝病等（二）D-D检测的临床意义 1D-D检测用于排除DVT静脉造影是最早应用的诊断DVT的方法，现任仍是诊断DVT的金标准。但是静脉造影价格昂贵，且具有侵袭性，存在一定的风险性，临床医牛和患者都不太愿意采用。另外许多
15、基法医疗单位也没有作静脉造影的设备。日前应用较多的是一些非侵袭性的诊断方法，如静脉加压超声（CUS）或：维扫描（DS）。非侵袭性方法比静脉造影伤害性小，也更为方便，但仍然比较昂贵，并且需要专门的技术人员操作。由于在非侵袭性方法诊断为阴性的患者中，约20%的患者在随访中发生VTE，所以进行连续的动态系列检测是必要的。但这不仅更增加了医疗费用，也增加厂患者的焦虑，因为他们无法在5天内得到明确的诊断结果。 由于D-D检测安全简单、快速、经济、敏感性高。尤其是大量研究已经证实了经典ELISA法对DVT的NPV可达100%，各种新型的快速D-D检测方法对DVT也高度敏感。表2总结了各种D-D检棚方法诊断
16、可疑DVT的特性。可以看出，如果采用D-D在人群小大规模筛选和排除DVT，叮以极大地节省时间和经费。闲为只行当患者的D-D浓度高于临界值时，才有必要采用更特异的超声波检查。 表2 D-D检测诊断可疑DVT或PE的特点回顾性的研究发现，在巳确诊的82例DIC患者中，FDF和D-D联合的诊断效率最高，为95%；而D-D本身的诊断效率可达80%，与联合FDP的方法相比，其敏感性没有降低（均为91%），只是特异性有所下降（68%vs94%）。D-D的诊断效率远远高于PT或PPT、血小板计数、纤维蛋白原、TT等。因此，作者认为，联介D-D、FDP和抗凝血酶检测是诊断DIC的最好策略，因为D-D和FDP可
17、以提供快速、特异的诊断，而抗凝血酶则有助于了解疾病的严重程度和预后，FDP因其快速，且比D-D便宜，可以用于诊断确立后的病情发展监测。 此外，D-D也可在一定程度上反映DIC的严重程度。DIC患者的D-D水平高于DIC前状态（pre - DIC）患者的水平，后者的水平高于正常人。 4D-D在心血管疾病的意义 D-D的升高与动脉粥样硬化的发生和严重程度有关，也可作为急性心肌梗死后复发的预测指标。 研究发现，在没有心血管疾病症状的患者中，有颈动脉损伤、且有高度血栓形成可能性患者的D-D明显高于没有颈动脉损伤的患者，也高于有颈动脉损伤，但血栓形成的可能性比较低的患者。同样，在有心血管疾病症状的患者，
18、如高血压患者中，D-D水平的升高也与动脉粥样硬化的发生有关。并且发现，D-D水下的升高与血浆脂蛋白（a）水平成正比。多元回归分析显示，D-D和脂蛋白（a）都分别是动脉粥样硬化的独立影响因子。 另外，D-D检测在急性心肌梗死后预测是否复发也有重要价值。心肌梗死后，如果患者的D-D水平持续偏高，复发的可能性比较大。但此预测价值存在性别差异，只有在男性患者中才有意义，其原因尚未明了。 5D-D在恶性肿瘤中的意义 恶性肿瘤患者大多伴有凝血和纤溶的异常，血浆D-D往往升高，且与浸润密切相关。 在21例转移性肿瘤患者中，D-D的平均水平高达2mg/L，远远高于同年龄和性别的正常对照组的平均水平（0.2mg
19、/L）。同时发现，升高的D-D水平与单核细胞表面结合的活化蛋白C（APC）高度相关，却与单核细胞组织因子（TF）的表达和凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）不相关，而后两者的水平在所研究的肿瘤患者中并未明显升高。这一结果反映了在这些患者中，发生了局部的凝血酶和纤维蛋白生成，而不是全身的凝血和纤溶的激活。 6D-D对术后抗凝治疗的指导意义 研究表明，D-D水平可用以调整低相对分子质量肝素（LMWH）的用量，对234例创伤手术的患者进行了抗凝预防治疗。LMWH的基础用量是28501 U/d，如果在术后第4天，患者的D-D水平高于2mg/L，将LMWH的用量增加每天两次。在术后5-7天作彩色多普勒超声检查
20、。结果发现，高危组（臀、股骨或膝关节置换术，n=102）的D-D水平明显高于十危组（膝关节的其它于术、胚骨、腓骨和足部手术，n=132）。术后第2天和第4天的D-D检测对确实存在血栓危险的患者（即手术第4天以后D-D水平仍高于2mg/L的患者）的敏感性和特异性分别为100%和72.8%。高危组的DVT发生率为3.9%，其中近端DVT的发牛率为1.96%；中危组有一例（0.8%）发生远端DVT。这一结果显示，D-D是监测术后凝血激活情况以及LMWH抗凝预防治疗的良好指标。7D-D在绝经后妇女激素替代治疗中的变化 绝经后妇女激素替代治疗（HRT）对凝血和纤溶系统的影响尚未定论。大多资料显示，HRT
21、有增强纤溶活性的作用，D-D水平有所增高。 8其它引起D-D升高的因素 在脑血管意外、溶栓治疗后、严重感染、脓毒血症、坏疽、先兆子痫、甲状腺功能减低、慢性肝病、结节病等情况F，常有机体凝血和纤溶系统的激活，也可见D-D升高。因此，D-D对住院患者的特异性比门诊患者差，更适用于门诊患者的VTE筛选诊断。 另外，一些生理因素也可影响D-D水平，如年龄和妊娠等。老年人D-D水平有所升高，与年轻人相比有显著性差别。在30-39岁组，D-D对VTE的特异性为72%；而在80岁以上患者，特异性降至9%。另有两组研究显示在70岁以上患者，D-D对VTE的特异性仅为14.3%和8.I%。妊娠妇女D-D水平也升
22、高，且双胎妊娠升高的更明显。因此，在分析D-D结果时，应考虑这些可能的影响因素。 10引起假阴性D-D的情况 由于D-D对VTE高度敏感，但特异性较差，人们把注意力主要集中在假阳性问题上。但是D-D检测也可能出现假阴性结果。既往血栓患者的D-D水平低于新近发牛血栓的患者水平，小血栓的D-D水平低于大血栓。因此，有一些时间校长的小血栓会出现亚临床表现或阴性的D-D结果。另外，D-D对远端血栓的敏感性低，如果患者的临床症状不明显，D-D也可能出现假阴性。四结语 迄今，D-D的最人临床意义是在排除诊断可疑VTE中的作用。D-D对VTE高度敏感，如果患者的D-D低于临界值水平，常可排除VTE。采用D-
23、D作为叮疑VTE的首选筛选指标，可以排除约30%的可疑DVT和PE患者；如果再结合临床预测患病率的盾，可排除诊断约50%的患者。这样不仪人人提高了诊断效率，而且降低了诊断费用，也较血管造影等方法更安全、快速，更方便于医生和患者。此外，D-D在诊断DIC、预测动脉粥样硬化发生、心梗复发和术后血栓形成、恶性肿瘤早期转移中的作用也受到厂关注。相信随着方法学的不断进步和临床应用研究的进一步广泛深入，D-D检测的应用前景将会更加宽广。 垦骨谣荚第宵萌慰镐誓谐妻瘫播畔轧皆忘冲淮坊颅秉涡桂础顽共重锑追综屉生岁何撂费腿儒涝锈觉棺荚拔辟各混粮巾刑禽苹陪乱作菏两豁痞僧舞嘛汉锅桌抠屠村禁壁诚摩介慢嫩撕丰田锋焙靡袍七
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