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1、目录丙型肝炎治疗药物研究与设计3以生命周期划分HCV治疗药物整理4HCV的结构.4HCV生命周期.5以生命周期划分HCV治疗药物整理.6总结和展望.13基于NS5A抑制剂的创新药物设计14前言.14NS5A靶点.14NS5A抑制剂研究进展.15BMS-790052(daclatasvir)研究.20创新药物设计.24参考文献.26TLR-7激动剂研究与设计.29目前已开发的激动剂.29咪唑喹啉胺（imidazoquinoline amine）类.291-取代吡唑啉酮（1-Substituted Pyrazolo(3,4-C) Ring）类.318-氧-去氮嘌呤类/咪唑并吡啶酮类.328-羟基腺
2、嘌呤（8-Hydroxyadenine）类.36扩环8-羟基腺嘌呤类.57艾沙托立宾（Isatoribine）衍生物类.61Bitriazolyl Acyclonucleoside类.64三氮唑类（Triazole）.65嘧啶类（Pyrimidine）.668-Substitued Benzoazepines类.68Aminodiazepine类.69未来可能的变动空间.70创新药物设计.71参考文献.76基于NS5B抑制剂的创新药物设计.79已报道Sofosbuvir类似物碱性部分结构总结.79sofosbuvir类似物碱性部分设计.80丙型肝炎治疗药物研究与设计丙肝病毒（HCV）是一种血液
3、传播病毒，丙型肝炎是由丙肝病毒引起的肝病，在世界范围内影响着大约1.5亿人口。HCV有六种基因型，在全球的分布不同（见下图）。丙肝的潜伏期为两周至六个月。最初被感染后，大约80%的人并不会出现任何症状。可能出现的急性症状包括发热、全身乏力、食欲下降、恶心、呕吐、腹痛、尿色深、大便颜色变浅、关节酸痛和黄疸（皮肤和眼白发黄）。大约75-85%的新感染者出现慢性肝病，慢性感染者中60-70%会出现慢性肝病，5-20%会出现肝硬化，1-5%会死于肝硬化或肝癌。丙肝是25%肝癌患者的致癌因素。每年，有35万余人死于与丙肝相关的肝脏疾病。目前，还没有预防丙肝的疫苗。干扰素和利巴韦林抗病毒联合疗法是目前治疗
4、丙肝的主要方法。但干扰素在全球并不能普遍获得，并不总是耐受良好，有些病毒基因型对干扰素的反应优于其它基因型，而且许多使用干扰素治疗的人未完成其疗程。结果，虽然一般认为丙肝是可以治愈的，但很多人却未能痊愈。近来，全口服、无干扰素的直接靶向病毒的新一代抗丙肝药物大量出现，为丙肝的彻底治愈带来希望，其中尤其以吉立德（Gilead）公司的sofosbuvir最具潜力。并且，临床实践证明，将多组分、不同机制的药物连用的鸡尾酒疗法的效果最优。所以，全球对新机制的强效抗HCV药物的研发正在如火如荼的进行中，我们也对其产生极大兴趣。第一章 以生命周期划分HCV治疗药物整理为选择出最具潜力的治疗靶点，我们首先对
5、目前已经披露的所有HCV治疗药物进行了总结，主要参考了近年的一些文献，然后按照其对应的HCV的生命周期进行分类，并对其风险、潜力进行简单打分1。一、 HCV的结构：如右图所示，HCV病毒体呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36-40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有剌突. 图一、HCV结构如下图所示，HCV的RNA大约由950010000bp组成，5和3非编码区（NCR）分别有319-341bp和27-55bp，含有几个顺向和反向重复序列，可能与基因复制有关。在5非编码区下游紧接一开放的阅读框（ORF），其中基因组排列顺序为5-C-
6、E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能编码一长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白（或称核心蛋白，Core）和两种糖蛋白（分子量为33KD的E1蛋白，分子量72Kd的E2蛋白），p7编码一种膜内在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对病毒的生活周期非常重要。NS2和NS3具有蛋白酶活性，参与病毒多聚蛋白前体的切割。此外，NS3蛋白还具有螺旋酶活性，参与解旋HCV-RNA分子，以协助RNA复制，N
7、S4的功能尚不清楚。NS5A是一种磷酸蛋白，可以与多种宿主细胞蛋白相互作用，对于病毒的复制起重要作用。而NS5B则具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，参与HCV基因组复制。图二、HCV的基因结构二、 HCV生命周期：HCV在体内的生命周期可分为以下过程：1、 病毒进入并脱壳，可能涉及LDL受体和粘多糖；2、 转译以及加工多聚蛋白NS3/NS4A；3、 HCV RNA复制，涉及到宿主内质网以及病毒自身的BS4B，BS5B和NS5A；4、 病毒组装和释放。图三、HCV的生命周期三、 以生命周期划分HCV治疗药物整理对HCV不同周期时药物所针对的不同途径，我们分四个阶段进行总结，大体如下图所示：同时，
8、我们对各个途径的新颖性，各个靶点、药物的风险、潜力进行了简单的评级，黑色四星（）为最高，白色四星（）最低。最后综合评价其风险与潜力，对靶点进行挑选。3.1、病毒进入并脱壳。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力病毒进入ITX-5061phase 2靶点：SR-BI避免耐药问题3.2、转译以及加工多聚蛋白。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力蛋白加工Telaprevir上市NS3/NS4Aincrease SVR rates from50% to70%Boceprevir上市NS3/NS4AHigh toward GT1, lower toward GT2 and GT3Sim
9、eprevir(TMC-435)Phase 3NDANS3/NS4AFaldaprevir (BI201335)Vaniprevir (MK-7009)Asunaprevir (BMS-650032)ABT-450Danoprevir (RG7227)Sovaprevir (ACH-1625)Vedroprevir (GS-9451)MK-5172Neceprevir (ACH-2684)Phase 2-3 NS3/NS4A与上述三个化合物结构类似加黑部分为第二代产品，活性更强，基因型更广，更耐突变GS-9132DiscontinuedACH-1095No Development Report
10、ed-NS2-NS3（理论阶段）3.3、HCV RNA复制，涉及到宿主内质网以及病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制Daclatasvir (BMS-790052)Phase 3, NS5A 极其强效。不耐突变，与其它药物连用效果好。Ledipasvir (GS-5885)Phase 3, NS5AGSK-2336805Phase 2 Clinical，NS5AABT-267Phase 3 ClinicalNS5AACH-3102Phase 2 ClinicalNS5AIDX-719Phase 2 ClinicalNS5AMK-8742Phas
11、e 2 ClinicalNS5APPI-668Phase 2 ClinicalNS5AGS-5816Phase 2 ClinicalNS5AA-972338DiscoveryNS5A?No Development ReportedNS5A3.3、HCV RNA复制，涉及到宿主内质网以及病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制Sofosbuvir (GS-7977)Phase 3 ClinicalNDANS5BMericitabine (RG7128)Phase 2 ClinicalNS5BVX-135Phase 2 ClinicalNS5BABT-
12、333Phase 3 ClinicalNS5B Palm-I/CBI207127Phase 3 ClinicalThumb-I/ABMS-791325Phase 2 ClinicalThumb-I/ALomibuvir(VX-222)Phase 2 ClinicalNS5B Thumb-II/BABT-072Phase 2 ClinicalPalm-I/CSetrobuvir (RG7790)Phase 2 ClinicalPalm-I/CGS-9669Phase 2 ClinicalNS5B Thumb-II/BTMC647055Phase 2 ClinicalNS5B Thumb-I/A3
13、.3、HCV RNA复制，涉及到宿主内质网以及病毒自身的BS4B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制IDX-375No Development ReportedNS5BNesbuvirDiscontinuedNS5BMK-0608No Development ReportedNS5BPSI-6130DiscontinuedNS5BPSI-938Phase 2 ClinicalNS5BdeleobuvirPhase 3 ClinicalNS5BTegobuvirPhase 2 ClinicalNS5B3.3、HCV RNA复制，涉及到宿主内质网以及病毒自身的BS4
14、B和NS5A。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力RNA复制JTK-109DiscontinuedNS5B-DiscoveryNS5BVX-759No Development ReportedNS5BClemizolePhase 1 ClinicalNS4BDEBIO-025Phase 3 ClinicalCyclophilin 抑制剂与其它药物联用，GT1miravirsen-3.4、病毒组装和释放。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价风险潜力释放celgosivirPhase 2Glucosidase inhibitors3.5、其它方式。途径/新颖性药物进展备注（靶点等）评价
15、风险潜力利巴韦林和IFN连用最早上市疗程长副作用较大疫苗GI-5005Phase 1bTherapeutic vaccine (Based on NS3-Core fusion protein)抗体CivacirPhase 3Anti-HCV enriched immune globulin productBavituximabPhase 2aminophospholipids on infected cells多样调节ZadaxinPhase 3A 28 amino acid peptide withimmunomodulating propertiesEMZ702Phase 2Interf
16、eron enhancer四、总结和展望：目前已有几十种DAAs和HTAs药物进入临床或已经上市，为HCV的彻底治愈带来曙光，并宣告了全口服、多组分、无干扰素、广谱、低副作用、高病毒学治愈率时代即将到来。虽如此，考虑到效价比、服药方便性、耐药突变等因素，还是很多优化改进之处。首先针对耐药突变问题，考虑鸡尾酒式疗法，以两种或三种不同作用靶点或机制的药物进行治疗；并且，针对耐药突变问题，临床试验显示组合中需要含有至少一个高突变门槛的药物成分。其次，丙肝广泛的基因类型（6种基因型100多亚型）也是一大挑战，尤其对非核苷类抑制剂以及第一代核苷类NS3-NS4A蛋白酶抑制剂以及NS5A抑制剂。综合上述总
17、结，我们认为HCV药物最具潜力治疗方式是将核苷聚合酶抑制剂（NS5B抑制剂）、NS5A抑制剂、蛋白酶抑制剂结合的疗法。但考虑到成本优势，小分子的TLR7激动剂也有其价值。建议选取下列化合物做起点，进行HCV创新药物项目开发：1、核苷类HCV核苷聚合酶NS5B抑制剂，此类抑制剂活性好、耐药性好，并且比较广谱： Sofosbuvir (GS-7977) Mericitabine (RG7128)2、联苯类蛋白酶NS5A抑制剂，此类抑制剂活性极高，并且和其它药物连用效果较好，然而不耐病毒突变：Daclatasvir (BMS-790052)3、TLR7激动剂：此类化合物也是治疗HBV潜在药物。第二章
18、 基于NS5A抑制剂的创新药物设计一、前言：世界范围内约1.5亿人感染HCV，并且目前针对HCV最理想的治疗手段是每周注射INF-并结合每天两次口服利巴韦林（RBV）。此治疗方案对GT1型HCV感染者效果不明显，并且存在明显副作用。针对直接抗菌药物的开发主要集中在NS3B/NS4A蛋白内抑制剂和NS5B RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂，但是还需要其他作用机理的药物以面对多基因型（6种），多亚型（100多种）的HCV病毒。NS5A在HCV复制和组装中起到重要作用，还与宿主免疫反应有关，是一个比较新颖的靶点，此类药物大多处在临床阶段，这给我们很多追赶机会研发出中国自主的丙肝治疗药物。并且此靶点对小
19、分子调节剂及其敏感，BMS-790052及其一系列类似物的IC50值（genotype 1b/bovine viral diarrhea virus replicon）达到皮摩尔级别。而GT1型HCV感染者属于难治性基因型，中国的丙肝患者多数属于此类，占HCV患者的58.2%，其中GT1a为1.4%，而GT1b为56.8%。BMS0790052等抑制剂的活性虽然达到较理想水平，然而还存在易被病毒突变逃逸、潜在细胞毒性、药代特性等方面问题有待改进。二、NS5A靶点：NS5A在HCV生命周期中的复制和组装阶段发挥作用，如下图一所示。此非结构蛋白质也参与若干细胞过程，比如干扰素抵抗以及凋亡调节。NS
20、5A是一个含有447个残基的磷蛋白，有三个蛋白域2。目前还没发现NS5A的酶功能，研究显示NS5A可能通过与其它的HCV蛋白或宿主细胞因子相互作用来发挥功能。图一 NS5A在HCV生命周期中的位置NS5A的区域一（1-213残基）包含一个锌离子结合区和一个两亲的氮端螺旋，此螺旋能够促进膜连接（membrane association）。区域二（250-342残基）起着调节的功能，比如和蛋白激酶PKR、PI3K以及NS5B相作用，并且，此区域也包含IFN敏感性决定区。最近研究又发现区域三（356-447残基）在病毒组装而不是RNA复制中起到关键作用。并且，此组装作用就是通过区域里的磷酸化作用调节
21、的。NS5A区域一中的36-198残基晶体结构显示其二聚为一个U型结构，并且内表面排列一系列碱性氨基酸，此氨基酸被认为是与病毒RNA结合部位。而抗NS5A抑制剂的突变位点也在NS5A的氨基端附近，位于蛋白和膜之间，表明抑制剂可能就结合在二聚体结合面。图二、NS5A区域一单体结构。区域一的分子表面，A、C两图显示区域一的表面电势，以不同颜色表示，红色为酸性，白色为中性，蓝色为碱性。B、D两图显示区域一的保守度，一不同颜色表示，品红色表示95%，淡粉红色表示75%-95%，白色表示100CYP1A2 (M) IC90100CYP3A4 (M) IC507.21.7CYP3A4 (M) IC9010
22、0CYP2D6 (M) IC50100CYP2D6 (M) IC90100CYP2C9 (M) IC5059.513.6CYP2C9 (M) IC90100Resistance MutationsL31 V4.2、BMS-790052的结合位点：BMS-790052的结合位点还未见报道，但其类似物BMS-411的可能结合位点已被披露4。BMS-411的结构如下图所示：结合方式通过QUANTA软件模拟，可见BMS-411活性状态为-扭曲形结构，横穿NS5A二聚体的接触面，其“盖子”区靠近Y93氨基酸，其核心区域平躺于氨基酸L31残基之下，氨基酸残基Q54靠近BMS-411的末端，并与螺旋的氨基酸
23、残基L28相接触。BMS-411与NS5A蛋白二聚体结合模式预测图，黄色棒球部分代表高耐药突变残基。4.3 构效关系研究：我们将化合物分成四个部分讨论起构效关系：1、 联苯的Linker/Core结构，这部分已经被密集的考察过；2、 咪唑部分，研究很少；3、 脯氨酸部分，仅有氟化和三元环化有报道；4、 氨基酸及其“盖子”部分，这部分被密集考察过。4.3.1 片段I的构效关系3c：片段I被相当密集的考察过，在通向BMS-790052的道路中，对此部分的考察是通过下面化合物1进行的：通过此部分考察发现此核心结构的平面性、指向、极性、长度都活性影响很大。首先，通过对烯烃电子生物等排体的考察，发现其所
24、连苯环倾向于反式共平面结构，而换成饱和烷基链后活性降低67倍，醚链活性比烷基链进一步降低16倍，对此，进行构象分析，认为两边的苯环倾向于共平面或平行排列，而不是处于正交平面：然后，考察链的长短对活性的影响，发现将乙烯基置换成亚甲基，羰基，氧，都会使活性极大降低。而延长饱和烷基链的链长，活性降低程度中等。并且发现用杂芳环取代乙烯基活性也是中等程度降低，然而这赋予了化合物优化药代特性的能力。同时，杂芳环的引入也使得某些化合物具备了对GT1a的中等程度的抑制活性。有文献报道了BMS-790052联苯结构Linker/Core的构效关系5。结果显示，缩短此结构长度使活性极大降低，而增加长度至三个苯环活
25、性基本保持，而毒性下降。引入杂环，改变联苯的角度，也对活性不理利。4.3.2 片段II和片段III的构效关系6：在片段II的咪唑4-位引入噻吩、呋喃或苯基导致活性下降，但引入小基团如氟、氯、溴等后，EC50基本不变，而EC90有中等程度提高。然而，卤素取代也使在淋巴细胞上的毒性提高。在片段III上的取代也表现出类似趋势，小体积的叠氮取代活性基本保持，并且（4-R）-叠氮取代在PBM、CEm和Vero细胞中没有表现出任何毒性（100M），（4-S）-叠氮取代表现出毒性（略）。而大体积的1,4-三氮唑取代使活性降低。将两个位置最优取代结合，得到化合物活性都能保持，并且发现咪唑溴代的叠氮产物在Ver
26、o细胞上无毒性（100M）。同时，在咪唑上的某些卤素取代也改善了化合物的药-药相互作用问题。4.3.3 片段IV的构效关系3d, e：在此处的改造主要为提高在GT1a上的抑制活性，对此部分的考察是通过下面化合物3进行的：首先发现，去除乙基，在GT1a上的活性降低，但两个化合物苯甲酰胺和苯胺环的二面角大小基本相同，说明原化合物的GT1a上活性的提高不是邻位取代引起的空间效应所致。然后发现将苯甲酸的苯环置换为吡啶环后，在GT1a和GT1b上的活性都得到提高。基于此，对一系列含氮杂环进行了筛选，发现异喹啉甲酰胺表现出与原来预测相一致的活性，即：其结构是有GT1b高活性的苯乙酸和有GT1a高活性的苯甲
27、酸的融合，而确实兼具了两者的优势，如下图所示，鉴于此，对此类结构进行了详细考察，主要考察取代基的影响，发现取代基效应非常明显，兵器最终得到了双取代化合物30（结构略），不仅在GT1两个亚型上表现强的抑制活性，在G-2a JFH（EC50 =2.2 nM）、G-2a NIH（EC50 = 14nM）、G-3a（EC50 = 3.2 nM）和G-5a hybrid（EC50 = 3.0 nM）也表现出强的抑制活性。但是比较30与化合物1，发现其亚型选择性不同。而比较30与化合物3苯甲酰胺和苯胺环的构想，发现相差很大，推测，可能化合物3的构象与NS5A GT1b的生物构象较符合，而30则与NS5A
28、GT1a的较符合。虽然化合物30的获得是一个里程碑式进步，但其类药性却存在问题，比如其sp3-碳原子的比例仅为22%，而上市药物一般为47%.所以，一步改造的改造策略选择了去环化，如下图所示：这个策略相当成功，得到了一个GT1a和GT1b活性都极大提高的化合物3g.2，并且有许多良好的性质，如耐突变、高选择性等。进一步考察中为避免烯烃顺反互变带来的影响，将烯烃置换为炔键，主要进行甘氨酸类多样性考察:发现此处化合物活性随着取代基碱性的减弱而降低，并得到活性进一步提高的化合物5g.1。五、创新药物设计综合相关文献专利，此类化合物的基本形状是-扭曲形结构，Linker/Core为柱状结构，两边为氨基
29、酸，其-扭曲通过环实现，如下图所示：此类化合物的Linker/Core的芳环结构给我们留下很大改动余地。据此，我们初步设计以了第一阶段工作计划，先合成以下几种Linker/Core的化合物，之后再选择活性较好的结构进行进一步环以及氨基酸部分改造：1、 并三环类:2、 四元环类：3、 其它类：参考文献：1.(a) Pawlotsky, J.-M., Therapy of hepatitis C: from empiricism to eradication. Hepatology (Baltimore, Md.) 2006, 43 (2 Suppl 1), 20; (b) Scheel, T.;
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