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1、治疗性克隆的研究现状和前景自然杂志27卷6期专题综述治疗性克隆的研究现状和前景刘厚奇王静教授,硕士,第二军医大学发育生物学研究中心,上海200433关键词干细胞克隆核移植技术发育本文介绍了治疗性克隆的含义,流程以及近期研究进展,分析了治疗性克隆的技术缺陷,社会问题和发展前景,阐述了治疗性克隆的科学价值和临床意义.1治疗性克隆的含义2005年2月18日,联合国大会法律委员会通过的联合国关于人的克隆宣言要求各国禁止有违人类尊严的任何形式的克隆人.中国对该宣言投了反对票,因为宣言提到的禁止内容也涉及治疗性克隆研究.人们用细胞核移植技术将体细胞核转移到去核卵细胞中,培养形成的囊胚内出现一群细胞,称为内
2、细胞群(innercellmass,IcM).这种细胞在体外培养可成团生长即为干细胞克隆,诱导分化(为细胞,组织或器官)后移植到病人体内以治疗疾病,人们谓之”治疗性克隆”.与此相对应的”生殖性克隆”,是用上述无性繁殖的手段制造出与体细胞的供体遗传完全相同的动物或人.两者的区别在于,前者是为了获取干细胞,而后者是为了获取新的生命个体.所以,以人的尊严为由反对治疗性克隆有些牵强.治疗性克隆与干细胞密切相关.干细胞是机体内的未成熟细胞,具有增殖分化潜能.在发育过程中,干细胞分化为功能细胞并在组织器官内发挥特定的作用.同时,它也失去了再分裂的能力,一定时间后衰老死亡.但是,机体组织器官内留下了一部分未
3、分化的原始细胞(干细胞),为组织器官的更新和修复储备细胞来源.然而,随着年龄的增长,这些储备细胞越来越少.特别在一些病理状态下,组织器官中的干细胞更不能满足机体的需要.就干细胞而言,其分化潜能也不一致.一种是全能干细胞,它具有形成完整个体的分化潜能.从内细胞群获得的胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES)就属于此类,它可以分化为全身所有的功能细胞.一种是多能干细胞,它具有分化出多种细胞组织的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,如骨髓多能造血干细胞,它可分化为多种血细胞,但不能分化为造血系统以外的细胞.还有一种是专能干细胞,只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织
4、基底层的干细胞,肌肉中的成肌细胞或卫星细胞.在体细胞克隆技术出现之前,科学家只能通过流产,死产或人工授精的人类胚胎获取干细胞进行研究.克隆羊多利的问世,意味着人们可以通过体细胞克隆出人类胚胎.因此,人胚胎干细胞(humanenbryonicstemcell,hES)的研究引发了伦理,道德,宗教,法律等方面的激烈争议.hES研究在许多国家都受到限制.然而,1998年11月美国威斯康星大学等机构的科学家从人类胚胎组织分离培育出ES细胞的突破性进展引起了各国科学家的关注,该成果于1999年被美国科学杂志评为当年世界十大科学成就之首.这是因为治疗性克隆研究可使病人获得所需的移植组织器官,届时,血细胞,
5、脑细胞,骨骼和内脏器官都可被替换.这给患白血病,帕金森氏症,心脏病和再生障碍性疾病的患者带来新的希望,为人类健康作出贡献.2治疗性克隆的制备流程2.1核移植技术核移植的成功受到许多因素的影响,包括受体细胞的类型,来源,重构的方法,激活,胚胎的培养,供体细胞的类型,供体和受体细胞周期的时期及卵母细胞供体的营养状况等.目前,人们一般将成熟卵母细胞用作受体胞质,在体外培养1324h后可进入细胞分裂期(M期),成熟后将细胞核移出:随后将供体(成体细胞)细胞核移到去核卵母细胞卵周隙内;继续培养68h后进行?333?ReviewArticleChineseJournalofNatureVo1.27No.6
6、电融合,使细胞核发生核膜破裂及染色体提前凝集,激活新的重构卵母细胞并发生细胞自主分裂;最后形成桑葚胚和囊胚1.目前,核移植成功形成胚泡的效率为12.4%16.8%,分离胚泡内细胞群细胞,建立均一的ES细胞系的效率为5%35%Ez.为提高人成体细胞核移植的成功率,黄禹锡教授等在实验中发现以下因素十分关键:首先是调整细胞融合和卵细胞激活之间的时间,使体细胞基因适当表达,以便细胞正常发育;其次是卵细胞激活方式,先与2.0mmol/L的6.二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine)温育,随后加入10mmol/L的离子导体(ionophore)作用5min以增加膜通透性;最后是改良的人
7、工合成输卵管液(hmSOFaa),采用人血清白蛋白和果糖取代原来的牛血清白蛋白和葡萄糖33.2.2ES的分离培养囊胚内有一群附在一侧的细胞团(内细胞群)是ES的来源.人们可用免疫外科手术,组织培养,机械剥离等手段分离这些ES并尽力避免内细胞群以外的胚外滋养层细胞的污染,以保证ES的纯度.同时,利用亚克隆纯化ES集落的方法可以得到生物学及形态学性状均一的ES细胞集落.ES的培养条件极为严格,目的是保持ES细胞的全能性分化能力.常用的抑制ES细胞和原始生殖细胞(embryonicgermcell,EG)细胞分化的因子是白血病抑制因子,维持ES细胞体外生长的因子是碱性成纤维细胞生长因子和forsko
8、lin,培养基中去除这些因子时ES细胞和EG细胞会自发分化.目前检测ES未分化的指标有碱性磷酸酶,膜蛋白ECMA-7,SSEA-1和OCT.4等.2.3体内外诱导分化ES细胞在适当的干细胞生长微环境下可以分化为体内任何一种成体干细胞.人们分别将8种生长因子用于ES细胞的诱导分化,得出如下结论:转化生长因子.1和激活素.A抑制内外胚层细胞发生,促进中胚层如肌肉细胞分化;视黄酸,碱性成纤维细胞生长因子,骨形成蛋白.4和表皮生长因子可以诱导内胚层和中胚层细胞的分化;肝细胞生长因子和神经细胞生长因子无特异性地促进三个胚层细胞发育.在体内,将SCNT_hES(成体细胞核移植来源的人ES细胞)植入免疫缺陷
9、性的小鼠体内,观察发现形成了包括三胚层来源的畸胎瘤.?334?2.4ES细胞移植利用组织工程学的方法,将治疗性克隆种植在一定支持物上,形成活的组织或器官替代物,用以修复,维持和改善人体组织和器官的功能.为保证稳定移植,避免畸胎瘤,ES细胞必须为性状均一的未分化细胞.分化后的ES细胞在功能上必须与正常组织细胞相同,用于治疗时是安全的.因此在植入人体内之前,围绕此种细胞的有效性及核遗传物质的安全性需作大量研究.3治疗性克隆的研究进展hES细胞最早由美国威斯康星大学的汤普逊和霍普金斯大学的吉尔哈特发现.他们从人类囊胚的ICM中分离出干细胞并在体外培养生长,在适当的条件下,分化为具有功能的细胞,包括神
10、经细胞,肌肉细胞,骨骼细胞和胰岛细胞.随后一些国家竞相研究ES细胞以治疗疑难疾病.2004年2月,黄禹锡通过成体细胞核移植技术,成功建立了全能性的胚胎干细胞系SCNT-hES-1.SCNT-hES.1细胞具有典型的胚胎干细胞形态和表面分子标志,并能在体外分化为胚体,在免疫缺陷型的小鼠体内形成畸胎瘤,包括所有三胚层来源的细胞.培养7O代后,SCNT.hES.1细胞仍维持正常核型且与成体细胞遗传性相匹配5l.2005年1月,威斯康星麦迪逊大学的学者把hES细胞转换为脊椎神经细胞,并证明神经外胚层分化为特异性运动神经元的过程中需要视黄酸,从hES细胞诱导而来的早期神经外胚层细胞表达Pax6,后期神经
11、外胚层细胞形成神经管样结构时表达Pax6和Soxl,在体外形成的运动神经元表达HB9,HoxC8,乙酰胆碱转移酶以及诱导肌管内乙酰胆碱受体聚集,激活电生理66.2005年2月,伊利诺易斯大学专家利用ES细胞美容和作为隆胸植物,通过将成体干细胞核移植来源的脂肪生成细胞注入生物配伍的水凝胶系统中(用PEGDA水凝胶决定预制形状和大小),生脂细胞聚合体结构在体外生成脂肪的媒介中孵育,植入免疫缺陷型鼠的背部.结果表明,这种生脂细胞在体内和体外都能合成脂肪,在体内表达脂肪生成基因PPAR-丫2.4周后,脂肪结构仍维持预定的形状和大小.此研究为预定形状和大小的软组织扩增及重建开辟了新的途径.2005年5月
12、,加利福尼亚大学的研究表明,瘫痪鼠的脊椎接受了hES细胞治疗后可恢复爬行.小鼠脊髓受损710个月后,植入hES细胞来源的OPC(少突神(自然杂志27卷6期专题综述经胶质祖细胞),移植细胞存活,分化为少突神经胶质细胞,7天后,增强了髓鞘重建能力并充分改善运动能力.这些研究证明了hES分化为功能性OPC的可行性,并在脊髓损伤后的移植早期有治疗功能.2005年5月19日,纽卡斯尔大学的斯托伊科维奇和纽卡斯尔国家生殖医学中心默多克领导的研究小组克隆的3例人类胚胎存活3天,一例存活5天.他们从11位妇女提取了36个卵细胞,抽出卵细胞核,从I型糖尿病人分离细胞并抽出基因物质,植入去核后的卵细胞,几天后分裂
13、增殖.他们提取了带有糖尿病基因缺陷的干细胞,用于研究基因缺陷引起病变的机理,通过DNA酶解图谱分析证明核移植成功,同时病变基因得以修复L9_9.4应用前景治疗性克隆提取ES细胞应用于细胞治疗与克隆人类胚胎用于创造人类之间有着巨大差别.hES细胞可以分化为三胚层的各种细胞,与鼠ES细胞不同,hES还可以分化为滋养层细胞或胚外内胚层.因此,ES细胞具有治疗众多疾病的潜在价值,包括脑,内脏,骨和其他许多组织的病变,如中风,帕金森氏症,心脏病,骨质疏松症,胰岛素依赖型糖尿病,白血病,脊髓损伤等.在治疗性克隆制备中,成熟细胞的细胞核注射到原有细胞核已被去除的卵母细胞的细胞质中.它的好处是,引起母体的排异
14、免疫反应的可能性较小,用病人的细胞克隆一个胚胎,从中提取干细胞,培育成与病人遗传匹配的组织,这样就可以解决免疫排斥问题.进一步可用于治疗免疫缺陷性疾病,如一些人的免疫细胞,表面蛋白CKR5阳性,抵御HIV感染.因此,AIDS病人的核植入CKR5阳性的卵母细胞,可能会重建健康的免疫系统.不可忽视的是,人类细胞核移植的研究目前仍面临着很多难题.受体细胞人卵母细胞来源有限,一方面应用人类卵母细胞有道德争议,另一方面捐赠者稀少;在早胚发育过程中胞质与核不匹配时会使正常发育中断,这是否影响核移植后hES细胞的衍化过程尚未可知;核移植后,成体细胞核基因组如何重排,是否会编码异常蛋白;Es细胞分化的诱导和靶
15、方向如何准确控制;ES细胞增殖的控制;小鼠”滋养细胞”营养人体干细胞易于造成动物细胞污染;把干细胞诱导培养成专一,成熟的细胞和组织,在近期还很难做到.总而言之,hES细胞的研究和应用前景广阔.治疗性克隆的成功应用可以拯救生命,维护健康,给人类带来新的希望.(2005年9月1日收到)1LiuD.H.LiuH.W.,ShanZ.Y.Currentsituationoftheropeuticcloningresearchintissueengineering.ZhongguoLinchuangKangfu.2004,8(14):2708-27102PerryA.C.Progressinhumanso
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17、roc.t1.Acad.Sc.,2000,97(21);11307.113125HwangW.S.,RyuY.J.,ParkJ.H.,efa1.Evidenceofapluripotenthumanembryonicstemcelllinederivedfromaclonedblastocyst.Science,2004,303(5664):1669.16746LiX.J.,DuZ.W.,ZarnowskaE.D.,efa1.Specificationofmotoneuronsfromhumanembryonicstemceils.NalureBio.technology,2005,23:21
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