慢病毒转染手册.doc

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1、 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的si

2、RNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3端形成14个U。U6和H1 RNA启动子

3、是两种RNA聚合酶依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达21ntRNA和50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶启动子和45T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有14 个U 3 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，

4、将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的

5、工具。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 慢病毒载体与其它常见病毒载体的特征比较目前常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。与其它逆

6、转录病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。1 病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒RNA病毒是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因感染细胞类型感染分裂和不分裂细胞感染分裂和不分裂细胞感染分裂细胞，但在干细胞中表达效率低表达丰度高水平表达高水平表

7、达高水平表达表达时间快（1-2 天）慢（2-4 天）快（1-2 天）滴度滴度高达1012pfu/ml最高可达10910TU/ml最高可达10910TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性动物模型不能得到转基因动物可产生转基因动物，效率达50以上可以，但很难启动子可以更换特异性启动子可以更换特异性启动子不需要启动子能否用于MIRCORNA可以可以不可以能否用于四环素诱导不可以TET-ON , TET-OFF不可以系统的目的与意义 对于一些较

8、难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 进行稳转细胞株的筛选； 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 解决的问题 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 进行稳转细胞株的筛选； 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对

9、于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 细胞相关的实验实验目的对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 实验流程1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体； 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒 液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞； 6. 通过

10、定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进 行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定 性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 慢病毒使用操作手册1慢病毒使用操作 2慢病毒安全使用规范 3悬浮细胞感染方法概要 4相关专业术语 5细胞培养器皿的相关参数 1、慢病毒使用操作手册 1.1慢病毒的储存与稀释: 1.1.1病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂 时放置于4 保存；如需长期保存请放置于-80（病毒置于冻存管

11、，并使用封口膜封口） A病毒可以存放于-80 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在 使用前需要重新滴定病毒滴度 B反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中 应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量 进行分装。 1.1.2病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细 胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4保存(请尽量 在三天内用完) 分装后使用。 1.2慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系 细胞 1.2.1慢病毒对各种细胞和

12、组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过 查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性） 1.2.2慢病毒感染目的细胞预实验 1.2.2.1慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 B在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有 血清，双抗或者

13、其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 C Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如： 病毒滴度为1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 1.2.2.2以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验 实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如 有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种35X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100

14、l；进行病毒感染时细胞的融合度约为 70%左右。 第二天，准备病毒：取出4保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于 离心管底部即可）；如果是冻存在-80的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验 室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有 慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。 第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验 a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基 b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液） c在目的细

15、胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液 d混匀后放于二氧化碳培养箱（37、5%CO2）孵育过夜 注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态 亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中 慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8 g/ml左右）来提高病毒的感染效率。 A第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在 感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最

16、 短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。第一次换 液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。 B第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率； 如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以通过Real-time RT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。 注意： Invabio提供的病毒载体上带有GFP 绿色荧光蛋白，用户可以在病毒感染96小时后用倒置 荧光显微镜观察GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。 如果慢病毒载体携带其他Marker Gene如RF

17、PBFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况 慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后96小时后观测荧光表达。感染 后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞 的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。 2、慢病毒使用安全使用规范 Invabio提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不 会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所 取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险， Inv

18、abio建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基 因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。如有疑问，请与我们联系。 使用时请参照如下所示进行实验： 2.1病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒， 请不要打开排风机。 2.2病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。 2.3操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒 污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头， 离心管，培养板，培养液请于84 消毒液或1%SDS 中浸泡过夜后弃去。 2.4用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧

19、紧培养瓶或盖紧培养 板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验 台之前，用70%乙醇清理显微镜实验台。 2.5如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心， 而且尽量使用组织培养室内的离心机。 2.6脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。 3、悬浮细胞感染方法概要 1.1根据细胞的量将细胞在1.5ml 管中离心收集然后用100-200ul 的无血清培养液稀释细胞 沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准 1.2按照MOI 换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml 管放在37度培养箱 中孵育30 分钟 1.3将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里 1.4加入足

20、够量的新鲜培养液 1.512 小时后换液 1.696 小时后观察细胞阳性率 4、相关专业术语 （详情可参考公司网站FAQ） 常用术语： MOI:病毒感染复数传统的MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体 与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。 一般认为MOI 是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI 被 普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本手册中提到的 MOI都是沿用这个概念。 然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细

21、胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu 表示病毒数量，因此其MOI 的含义 与传统的概念相同。 MOIstands for Multiplicity of Infection. It is the ratio of infectiousvirus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI isin the range of 0.1 (meaning that you inoculate 1 virus particle for every 10cells) to 0.01. The ge

22、neral theory behind MOI is to introduce one infectiousvirus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cellwhich leaves a percentage of cells uninfected. This occurrence can be reduced by using a higherMOI to ensure that every cell is

23、 infected. 5、细胞培养器皿的相关参数 Flask/DishSurface (mm)Cell numberMedia Volume96 well plate501.5-5.010100 l48 well plate1003.0104-1.010200 l24 well plate2008.0104-2.010500 l12 well plate4011.6-4.0101.0 ml6 well plate9623.0-8.0102.0 ml35mm9623.0-8.0102.0 ml60mm28271.0-2.5106.0 ml100mm78542.5-6.41010.0 ml慢病毒载

24、体的包装与纯化 1实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,感染Hela细胞后定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。 2实验材料 2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株 慢病毒载体系统（Tronolab）该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表达绿色荧光蛋白（GF

25、P）. pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件. 细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株 大肠杆菌菌株DH5。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 2.2主要试剂 试剂名称 生产厂家 货号 包装细胞293T细胞株 中科院上海细胞所 大肠杆菌菌株DH5 Invitrogen公司 胎牛血清 Invitrogen公司 胰蛋白酶 Invitrogen公司 限制性内切酶 Fermentas T4DNA连接酶 NEB公司 M0202V 质粒DNA提取试剂盒 A

26、xygen公司 制备感受态试剂盒 BIOSCIENCES 凝胶回收试剂盒 Qiagen公司 1kb/100bpladder Fermentas 2.3 主要仪器 仪器名称 生产厂家 货号 PCR仪 Applied Biosystems公司 电泳仪 Bio-rad公司 荧光倒置显微镜 奥林帕斯 冷冻超速离心机 Hitachi 细胞培养箱 healforce 凝胶成像仪稳压DNA电泳仪 Tianneng 恒温摇床 上海博讯仪器 电热恒温培养箱 上海博讯仪器 移液器 eppendorf 电热恒温水浴锅 上海一恒实验设备有限公司 数码凝胶处理系统 天能科学仪器 一次性平皿 Cell-star 烧瓶 3

27、慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱 该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的穿梭质粒。其中穿梭质粒（目的穿梭质粒）含有能表达绿色荧光蛋白（GFP）；pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件。 3.1穿梭质粒：目的穿梭质粒 3.2pRsv-REV 3.3pMDlg-pRRE 3.4pMD2G 4慢病毒生产实验步骤 4.1慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293 T细胞，细胞密度为0.510时；重新接种于25 mL的15cm细胞培养皿，37，50 mL/L CO2培养箱内培养； 4.2制备慢病毒包装系

28、统中四种质粒DNA溶液； pRsv-REV 10 g， pMDlg-pRRE 15 g， pMD2G 7.5 g, 干扰质粒 20 ug 加入无菌水定容至1800 L, 再加入CaCl2 (2.5 mol/L) 溶液200 L，混匀，加入2BBS缓冲盐溶液2000 L，室温放置2030 min； 4.3 当细胞密度达60%70%时转染. 将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.； 4.4每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h.； 4.5收集转染72 h的293T细胞上清液； 4.6将收集的上清液于4，4000 g离心10 min，收集上清液； 4.7将各种不同RNA干扰质粒上清液以0.45 m滤器过滤； 4.8于40 mL超速离心管中，4，25000 r/min离心20 min； 4.9而后以冰PBS液，分别溶于500ul Dmem,和500ul PBS重旋病毒沉淀于4溶解过夜 参考资料 慢病毒与腺病毒、逆病毒特征比较