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1、园 艺 学 报 2014，41（6）：12181226 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131120；修回日期：20140508 基金项目：国家高技术研究发展计划（863）项目（2011AA1008） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangyanlong） 岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析 张响玲，张延龙*，牛立新，孙道阳，梁振旭 （西北农林科技大学林学院，陕西杨凌 712100） 摘 要：为了
2、研究黄瓜花叶病毒（CMV）诱导的岷江百合（Lilium regale）病程相关蛋白PR10基因在抗病毒防御反应中的作用，对岷江百合叶片接种CMV，采用RACE技术获得岷江百合LrPR10的全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析；利用实时荧光定量PCR对LrPR10在各器官特异性以及CMV和水杨酸（SA）处理后的表达模式进行了测定分析。结果表明：LrPR10全长756 bp，可编码由157个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白具有病程相关蛋白典型的Bet_v1_like保守结构域；LrPR10在岷江百合鳞茎中相对表达量最高，在嫩叶中最低；该基因可以被CMV和SA诱导上调表达，岷江百合、卷丹（L. la
3、ncifolium）和宜昌百合（L. leucanthum）在CMV接种处理后LrPR10的相对表达量分别在4 d、4 d和1 d达到最大值，分别为处理前的58倍、27倍和292倍，在SA处理后LrPR10的相对表达量都在8 h达到最大值，分别为处理前的34倍、8倍和38倍。以上结果表明LrPR10在岷江百合抗黄瓜花叶病毒防御反应过程中发挥作用。 关键词：岷江百合；黄瓜花叶病毒；LrPR10；RACE；表达分析 中图分类号：S 682.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1218-09 Cloning and Expression Analysis of LrPR
4、10 Gene from Lilium regale Induced by Cucumber mosaic virus ZHANG Xiang-ling，ZHANG Yan-long*，NIU Li-xin，SUN Dao-yang，and LIANG Zhen-xu （College of Forestry，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China） Abstract：This study aimed to clone PR10 gene which was up-regulated in the leaves of L
5、ilium regale infected by Cucumber mosaic virus（CMV）and examine the role of PR10 gene in defense response against CMV. The full length of LrPR10 was amplified by RACE and analyzed with bioinformatics tools. Real-time PCR was performed to check the transcript levels of LrPR10 in different organs of L.
6、 regale，CMV-inoculated and salicylic acid（SA）treated leaves. The results showed that the length of complete cDNA of LrPR10 was 756 bp，which encoded 157 amino acids consisting of a Bet_v1_like conserved domain of pathogenesis-related proteins. The transcript level of LrPR10 was the highest in bulbs，w
7、hereas the lowest in tender leaves. LrPR10 was significantly induced by CMV inoculation and SA treatment. Transcript level of LrPR10 reached a peak at 4 d，4 d and 1d in the CMV-inoculated leaves of L. regale， 6期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析 1219 L. lancifolium and L. leucanthum respectively，whi
8、le the maximum relatively expression values in CMV-inoculated samples were about 58，27 and 292 times higher than the uninoculated ones in these three species. After SA treatment，LrPR10 peaked at 8 h in L. regale，L. lancifolium and L. leucanthum and the maximum relatively expression values in treated
9、 samples were about 34，8 and 38 times higher than the untreated ones in three species. We hypothesize that LrPR10 from L. regale probably plays an essential role in plant defense against CMV. Key words：Lilium regale；Cucumber mosaic virus；LrPR10；RACE；expression analysis 自Stewart（1896）首次报道侵染百合的黄瓜花叶病毒（
10、CMV）到现在，已经确定能够侵染百合的病毒有19种（Yamaji et al.，2001；刘博，2009），CMV是其中危害最为严重的病毒之一，常与其他病毒进行复合侵染（Asjes，2000）。百合育种专家都亟希望利用分子生物学的方法获得抗病毒种质资源（Lipsky et al.，2002；徐秉良 等，2004；Benidito et al.，2005；王进忠 等，2005），以选育抗病毒百合新品种。 岷江百合（Lilium regale）被公认为百合属中抗病性优异的种类（Yoshiji et al.，1996；Yumi et al.，2000），对尖孢镰刀菌具有很高的抗性（Lim et al
11、.，2003），对病毒病的表现尤其突出。王仙芝等（2008）用RT-PCR技术对岷江百合及秦巴山区的5种野生百合进行抗病毒病检测，发现岷江百合对CMV、百合无症病毒（LSV）及百合斑驳病毒（LMoV）的抗性达到免疫水平。 PR10蛋白最早在真菌诱导的欧芹培养细胞中发现（Somssich et al.，1986），目前已经从70多种植物中鉴别出了100多种PR10基因（Wen et al.，1997；Markovic-Housley et al.，2003；Colditz et al.，2007）。研究表明，PR10蛋白具有体外抑菌活性和核酸酶活性（Park et al.，2004；Liu et
12、 al.，2006），能被病原体（包括病毒、细菌、真菌）、SA、脱落酸、茉莉酸甲酯或乙烯诱导表达（Constabel & Brisson 1992；Lo et al.，1999；McGee et al.，2001；贺明阳，2012；Parinita et al.，2013）。van Loon和van Strien（1999）及Park等（2004）认为，PR10蛋白可以通过降解病毒的RNA来增强植物的抗性。在麻风树中，PR10蛋白具有核酸酶活性，并且对炭疽病菌表现出抗性（Parinita et al.，2013）。PR10在华东葡萄中可以被葡萄霜霉菌诱导表达，将该基因转到易感病的葡萄品种中可以
13、增强其对霜霉菌的抵抗能力（He et al.，2013）。 本研究中根据岷江百合在CMV诱导下cDNA文库中的PR10的EST序列设计特异引物，利用RACE技术克隆全长cDNA，并通过实时定量PCR分析LrPR10在岷江百合不同器官中的表达模式，以及CMV和SA处理后该基因的表达情况，旨在了解该基因的有关特性及在抗病防御反应中的作用，为进一步开展百合抗病毒育种工作奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料及其处理 供试植物材料岷江百合（Lilium regale）、卷丹（L. lancifolium）和宜昌百合（L. leucanthum）均取自西北农林科技大学百合资源圃，材料的处理及取样时间为
14、2012年46月。已知岷江百合、卷丹和宜昌百合复合接种LMoV和CMV的相对抗病毒指数分别为0.64、0.64和0.18，抗病程度分别为高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。黄瓜花叶病毒从该资源圃中感染该病毒的西伯利亚百合（L. Oriental HybridsSiberia）叶片中获得。 分别采集正常生长的岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根等器官，于液氮中冷冻后，80 保1220 园 艺 学 报 41卷 存。 选取正常生长的岷江百合、卷丹和宜昌百合，将CMV毒源植株黑暗处理8 h后取嫩叶1 g，用已灭菌的0.01 mol L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）稀释至0.001 mol L-1，研磨后
15、加少量石英砂摩擦接种叶片，接种后用蒸馏水冲洗。取样时间为接种后0、1、2、3、4、5和6 d，将所取样品液氮速冻后80 保存。 用2 mmol L-1的SA喷洒到正常生长的岷江百合、卷丹和宜昌百合叶片上，于处理后0、2、4、6、8、10和12 h取样，样品经液氮速冻后，置于80 保存。 1.2 岷江百合基因LrPR10的全长克隆 百合叶片总RNA的提取采用改良的CTAB法（尹慧 等，2008）。反转录按照Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit进行。 根据已获得的黄瓜花叶病毒诱导的岷江百合cDNA文库中的EST核心序列设计3
16、RACE特异引物，Gene Racer 3Primer：5-AGCTCGCTCCCGAGATCTTGCTCAGT-3，巢式特异引物Gene Racer 3Nested Primer：5-GGGTGCATCGTGAAGGTGGTGACAG-3。根据获得的基因3端序列设计5RACE特异引物Gene Racer 5Primer：5-TTCATTCTGCAAGTGGTTCTAAGCA-3，巢式特异引物Gene Racer 5 Nested Primer：5-AGGTAAGCTTCTGCAGCCTTGAAGAG-3。引物设计用Primer 5.0软件进行并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 以接
17、种黄瓜花叶病毒的岷江百合各时期叶片提取的RNA混合样为模板，使用 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）进行RACE cDNA扩增。扩增产物经1%的琼脂糖电泳检测，回收目标条带连接至pGEM-T Easy克隆载体（Promega）后测序（北京奥科鼎盛生物技术科技有限公司）。对测序获得的LrPR10的5端序列和3端序列利用DNAstar软件进行拼接，获得岷江百合基因LrPR10 cDNA 全长序列。 1.3 岷江百合基因LrPR10的生物信息学分析 采用NCBI的ORF finder预测开放阅读框；通过NCBI网站上的BLAST搜索，查找
18、LrPR10的同源序列；用 NCBI 的 protein blast进行蛋白序列保守结构域分析；通过DNAman软件分析LrPR10基因的编码氨基酸以及比较氨基酸序列的同源性；利用MEGA 5.1构建系统发育树；利用 ProtParam 程序（http：/expasy. org/cgi-bin/protparam）预测蛋白质的分子量和等电点；根据SignalP 4.1 Server（http：/www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）分析蛋白质的信号肽；用TMHMM（http：/www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）进行蛋白质的跨膜
19、结构域分析；据ProtScale（http：/www. expasy. org/cgi-bin/ protscale. pl）分析蛋白质的亲水性。根据Motif Scan（http：/hits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN/）研究蛋白motifs。 1.4 岷江百合LrPR10表达的器官特异性分析 根据已获得的岷江百合基因LrPR10 3端非保守区序列设计合成定量的引物LrPR10-1：5- TAAG AGGCTGGCTACCCCAATTC-3，LrPR10-2：5- ATTGGGGTAGCCAGCCTCTTACA-3。以18S rRNA基因（GenBank登录号：D
20、29775.1）为内参基因，其引物为18S rRNA-1：5-TCTCAACCATAAAC GATGCCGA-3，18SrRNA-2：5-TTTCAGCCTTGCGACCATACTC-3。分别取岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根等器官的总RNA各1 g，反转录为cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time）（TaKaRa，Japan）的说明书进行实时荧光定量，在IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）上检测基因在不同组织的相对表达量，每个样品设3次重复。PCR 扩增6期 张
21、响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析 1221 程序为：95 变性1 min；95 变性30 s，58 退火30 s，72 延伸30 s，40个循环。用Excel 2007和Origin 7.5对数据进行计算和处理，定量数据的处理方法采用2-CT法。用SPSS软件进行差异显著性分析。 1.5 岷江百合LrPR10的表达模式分析 分别取CMV和SA处理后不同处理时间的叶片总RNA 1 g，进行表达模式分析，本操作所用的引物、PCR程序及数据处理方法均同1.4所示。 2 结果与分析 2.1 岷江百合LrPR10全长cDNA序列的获得 RACE扩增后，得到长度为405 b
22、p的3 cDNA序列和长度为518 bp的5 cDNA序列（图1），利用DNAstar软件进行拼接后，获得了756 bp的全长cDNA。开放阅读框（open reading frame，ORF）长474 bp，编码157个氨基酸。将该基因命名为LrPR10，GenBank登录号为KF690636。 图1 岷江百合LrPR10的RACE扩增结果 Fig. 1 RACE amplification product of LrPR10 from Lilium regale 2.2 岷江百合LrPR10的生物信息学分析 经ProtParam预测LrPR10蛋白的分子量为16.8 kD，等电点为5.39
23、，为酸性蛋白。利用SignalP 4.1分析可知，该序列无信号肽，为非分泌蛋白。经TMHMM预测该蛋白不具跨膜区，属于胞内蛋白。通过ProtScale分析表明，LrPR10蛋白为亲水性蛋白，其亲水性氨基酸含量高于疏水性氨基酸含量。通过NCBI的protein blast分析显示，LrPR10蛋白具有病程相关蛋白典型的Bet_v1_like保守结构域（图2）。 图2 LrPR10蛋白的保守域分析 Fig. 2 Conserved domain analysis of LrPR10 protein 1222 园 艺 学 报 41卷 Motif Scan分析表明，LrPR10蛋白含有1个N糖基化位点
24、（56 59位氨基酸），4个酪蛋白激酶磷酸化位点（40 43、83 86、92 95和127 130位氨基酸），3个N豆蔻酰化位点（47 52、87 92和124 159位氨基酸），该编码蛋白3 152位氨基酸具有病程相关蛋白Bet_v_I家族保守域。 氨基酸序列比对结果（图3）显示：LrPR10蛋白与同属的麝香百合中6种PR10蛋白（Lilium longiflorum AAD17336.1、AAF21625.1、AAF21624.1、AAF21623.1、AAF21622.1、AAD17335.1）的同源性分别为91%、89%、89%、88%、88%、87%；而与小麦（Triticun a
25、estivum，TaPR10，ACG68733.1）、高粱（Sorqhum bicolor，AAVV83209.1）、玉米（Zea mays，NP 001131012.1）、番红花（Crocus sativus，ADL09408.1）的PR10蛋白同源性分别为54%、54%、53%、53%，这些蛋白都具有病程相关蛋白Bet_v1_like保守结构域。 图3 岷江百合LrPR10蛋白与其他植物PR10蛋白的氨基酸序列同源性比对 Fig. 3 Alignment of amino acid sequences of LrPR10 protein and PR10 protein from othe
26、r plants 将LrPR10蛋白与NCBI检索的其他物种中16种PR10蛋白进行多序列比对后构建系统发育树（图4），结果显示，岷江百合PR10蛋白与同属的麝香百合LlPR10-1（L. longiflorum，AAD17335.1）和LlPR10-7（L. longiflorum，AAD17336.1）蛋白的亲缘关系最近，与单子叶植物玉米（Zea mays，NP 001131012.1），高粱（Sorqhum bicolor，AAVV83209.1），水稻（Oryza sativa，AAL74406.1），小麦（Triticun aestivum，ACG68733.1），黑麦草（Loliu
27、m perenne，AEO11776.1）中的PR10蛋白具有相对近些的亲缘关系，与裸子植物加州山松（Pinus monticola，AFR78290.1）的PR10蛋白亲缘关系相对较远，而与双子叶植物PR10蛋白的亲缘关系最远。 6期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析 1223 图5 LrPR10在岷江百合不同器官中的相对表达量 不同字母表示差异显著（P 0.05）。 Fig. 5 Expression analysis of LrPR10 gene in different organs of Lilium regale Different letters
28、 indicate significant differences among different organs（P 0.05）. 图4 几种植物PR10氨基酸序列的系统发育树 数字代表进化距离。 Fig. 4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the PR10 from several plant species Numbers stand for evolutionary distance. 2.3 LrPR10在岷江百合不同器官中的表达 LrPR10在岷江百合嫩叶、嫩茎、花、鳞茎、根等各器官中的表达量均不相同，在鳞茎中的表达量最高，
29、在嫩叶中的表达量最低（图5）。说明LrPR10在岷江百合中存在组成型表达。 2.4 CMV侵染后LrPR10的表达模式 岷江百合、卷丹和宜昌百合接种CMV后LrPR10的相对表达量均增加，达到最大值的时间分别为4 d、4 d和1 d（图6）。LrPR10的相对表达量在高感病毒的宜昌百合中最高，为接种前的292倍，在高抗病毒的岷江百合中相对表达量居中，达处理前的58倍，在高抗病毒的卷丹中表达量最低，为接种前的27倍（图6）。不同抗性的百合中LrPR10的表达情况存在明显的差异，说明CMV可以诱导LrPR10的表达，该基因是一个百合抗病毒相关基因。 2.5 SA处理后百合中LrPR10的表达模式
30、SA处理不同抗性百合后，LrPR10的表达量与百合的抗性有关。在高抗病毒的岷江百合中的表达量明显区别于卷丹和高感病毒的宜昌百合。 1224 园 艺 学 报 41卷 SA处理后，岷江百合、卷丹和宜昌百合中LrPR10均被诱导表达，该基因在3种不同抗性的百合中均在8 h时达到最大值，但表达量存在明显的差异，在高抗病毒的岷江百合中相对表达量为处理前的34倍，而高抗病毒的卷丹中相对表达量仅为处理前的8倍，高感病毒的宜昌百合中表达量的最大值为处理前的38倍（图7）。由此可见，百合可以通过SA信号传导途径参与抗病毒反应。 3 讨论 本研究中，3种不同抗性的百合叶片接种CMV后，LrPR10的表达量均有较大
31、提高。其中，高感病毒的宜昌百合中表达量最高，高抗病毒的岷江百合中表达量居中，高抗病毒的卷丹中最低（图6），岷江百合和卷丹仅为宜昌百合中的20%和9%。已知植物具有复杂的抗病机制，其对某种病毒产生抗性是由结构抗病毒机制和生化抗病毒机制共同作用的结果。作者所在研究组以前的试验结果表明，岷江百合和卷丹都易感蚜虫，而宜昌百合对蚜虫却高抗（王仙芝，2013），由此可知宜昌百合的结构抗病毒能力远强于岷江百合和卷丹。而通过人工复合接种LMoV和CMV试验证明，3种百合接种初期均易被病毒感染，但最终对病毒的抗性表现却是高抗、高抗和高感（王仙芝，2013）。由此可知，较强的结构抗病毒能力使高感病毒的宜昌百合中L
32、rPR10的表达量远大于高抗病毒的岷江百合和卷丹。以上结果表明，岷江百合LrPR10受CMV的诱导，且表达量与百合本身的抗性存在一定的关系，是一个百合抗病毒相关基因。 水杨酸依赖途径是植物中主要的防卫反应信号途径之一（彭金英和黄勇平，2005）。依赖于水杨酸的信号转导途径，可以通过外源施加SA激活相同的一套PR基因（王冬良 等，2005）。已知SA是植物对病原菌产生抗性反应的信号分子，能提高许多病原体响应基因的表达（Thomma et al.，2001）。已有研究表明SA可诱导辣椒、刺茄等植物中PR10基因的表达（Park et al.，2004；Liu et al.，2006）。本研究中，S
33、A处理不同抗性的百合叶片后，实时定量结果显示LrPR10上调表达，岷江百图6 岷江百合、卷丹和宜昌百合接种CMV后 LrPR10的相对表达量 同一时间，不同字母表示组间差异显著（P 0.05）。 Fig. 6 Expression analysis of LrPR10 in Lilium regale， L. lancifolium and L. leucanthum in response to CMV In the same period，different letters indicate significant differences among groups（P 0.05）. 图7
34、岷江百合、卷丹和宜昌百合SA处理后 LrPR10的相对表达量 同一时间，不同字母表示组间差异显著（P 0.05）。 Fig. 7 Expression analysis of LrPR10 in Lilium regale， L. lancifolium and L. leucanthum in response to SA In the same period，different letters indicate significant differences among groups（P 0.05）. 6期 张响玲等：岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析 1225 合、
35、卷丹和宜昌百合均在8 h时达到表达量的最大值，但最大值存在明显的差别，分别为未处理的34倍、8倍和38倍。结果表明，LrPR10可以通过SA信号传导途径参与岷江百合抗病毒的过程，并且该过程与百合本身的抗性有关。 通过黄瓜花叶病毒诱导岷江百合中LrPR10的克隆及表达分析结果认为，LrPR10基因是百合抗病毒相关基因，而对于LrPR10在岷江百合抗病毒中的具体抗病作用以及抗性机理尚需进一步的研究。 References Asjes C J. 2000. Control of aphid-borne Lily symptomless virus and Lily mottle virus in L
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