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1、实验四 植物病原细菌及所致病害观察一、概述：植物细菌病害的野外及室内的诊断鉴定，是对植物细菌病害最基本实践之一。在未经诊断确定其为细菌病害之前，许多深入的工作将无从进行。植物细菌害的病状以组织坏死类型的病状较为普遍常见，少数下也可由于细菌寄生于输导组织而造成萎蔫，由于增生或抑制引起的畸形则为数更少。植物薄壁组织被害后常表现为水渍状半透明的局部性斑点，其后颜色常加深为褐或黑色而枯死。叶部病斑的发展常受叶脉的限制和影响，成为多角形状。在输水组织中定殖和扩展的细胞，常使叶脉、输导组织变为黑褐色。在增生而致畸形的病害中，则罕有水渍状、变色、组织坏死等表现。局部性的细菌病状在高湿条件下及雨后较为明显，故
2、在实验室内常用保湿方法以诊断细菌病害，绝大多数的细菌病害，都可向病部表面泌出含大量细菌个体的液滴，称为“溢脓”病症，是植物细菌病害的诊断特征。一些病组织内细菌数量很少的细菌病害，以及在湿度不足时，许多细菌病害都很难表现出溢脓病症，为此需进行室内显微镜检验以察明在病组织是否有细菌的存在，才能作出准确的诊断。二、实验目的：1认识植物细菌病害的症状类型及特点。2学习植物病体病原细菌的显微镜检验。三、实验材料及准备：棉花角斑病 Xanthomonas malvscearium核桃黑斑病 X . jangladium 柑桔溃疡病 Xanthomonas citri桑烂头病 Pseudomonas mor
3、i女贞叶斑病 Pseudomonas ligustri十字共科软腐病 Pseudomona solanacearum杨树根癌病 Agrobacterium tumefaciens灭菌水、小剪刀、刀片、尖口镊子、载下片、纱布等各组准备一套。四、实验方法及步骤：1症状诊断观察供给的腊叶标本及新鲜的病害标本，注意各个病害表现的具体特点和它们的共同特点。有无“溢脓”病症，呈何种表现状态？2显微镜检验对病症不显著的细菌病害，或是经病状诊断不能确诊的病害，须经显微镜检验，以检视病组织中有无细菌的存在。因为极少数细菌病害，除根癌病等外，绝大多数的植物细菌病害的病组织中均有多数细菌个体，解剖检验时可以见到细菌
4、大量的从病组织中涌出。据此，可以确定为细菌性病害。在操作时应，除以下诸点： 病组织中腐生的细菌：许多植物病害在寄组织死亡之后，常可有腐生细菌发生。为排除此种可能，应当选择新发生的病斑，或是剪取病斑边缘的组织进行检验。 病害组织表面污染物排除。病害组织表面常沾染其它的微生物，因此，应在流水下仔细冲洗经过上述初选的带病斑的小寄生组织。 器械及用具的污染：所用器械，如刀片、剪刀、玻片、镊子等物，要经过70%酒精棉球擦洗。在上述准备工作完成后，按下列方法进行镜检：取载玻片，仔细以纱布擦净，在灯焰上灼烧灭菌，待凉；取经过选择及冲洗的病组织块，在玻片上用刀片取病健相间的组织；约为5毫米大的方块。材料放于另
5、一玻片上，用刀片通过病斑切成数块，然后在玻片上滴1%蛋白胨液一大滴，加盖玻片覆盖，补足或吸去多余的水，无1%蛋白胨液时，一般灭菌水，或过滤的凉开水亦可。在显微镜下检视病组织的切面，光线要适中，不宜太强，放大倍数在100-300倍时较适宜，注意在患病组织的切面上，寻找自组织中涌出的细菌群体，如云雾状徐徐排出。为证明观察无误，用健康组织按同样方法作镜检为反证。镜检步骤所观察的玻片，如须观察菌体的形态，可以经干燥固定后供作染色观察。五、实验作业对供观察的各类植物细菌病的症状分别进行拟述。根据柯赫氏准则，说明症状诊断及病体显微镜检验的意义。附录 细菌的革兰氏染色和鞭毛染色本实验只做与病原鉴定有关的革兰
6、氏染色和鞭毛染色。其它如菌体、芽孢、荚膜、抗酸等染色方法，可参阅植物病理研究方法或其它参考书。1革兰氏染色革兰氏染色反应是细菌的一个重要特性，细菌可分为革兰氏阳性（+）和阴性（-）两个类群，植物病原细菌中除棒状杆菌属（Corynebacterium）外，其它各属均为阴性。染色剂的制备：A草酸铵结晶紫甲液：结晶紫 2克乙醇（95%）20毫升乙液：草酸远 0.8克蒸馏水 80毫升混合甲乙两液，可长期保存B碘液碘1.0克 克蒸馏水300毫升碘化钾 2.0C番红1%水溶液或稀释齐氏品红液玻片的洗涤：制备细菌涂片时，必须用无酯的载玻片，清洗方法如下：载玻片浸于稀盐酸溶液中，取出凉干并以脱酯纱布擦洗。清水
7、冲洗干净，以优质去污粉调成糊状，仔细地擦抹每一玻片及其边缘。不经冲洗放在玻片架上摊上凉干。使用前，用脱脂纱布擦去玻片表面的去污粉，勿使粉屑残留在玻片上。玻片保存在防尘的容器内，备用。涂片：取一般载玻片，如蒸馏水一滴；以移菌环按无菌操作获取 经纯培养后待鉴定的菌株一环，在水滴中制成悬浊菌液；无酯玻片中央加蒸馏水一滴，用移菌环移取菌液至水滴中，使均匀悬浮，并涂布成薄层，凉干；固定：涂片在灯焰上缓慢通过三次，以玻片置手背上不感烫手为宜。染色：滴草酸铵结晶紫液于涂片上，染色1分种。倾去染液，使覆盖染色部分1分部。滴加碘液，使覆盖染色部分1分钟。倾去碘液，不经水洗。在涂片上滴95%乙醇，以洗脱染液。在洗
8、脱过程中，轻轻振动玻片，直至无染液自玻片上渗出为止，为观察清晰可用白纸为反衬观察。滴加复染液1%番红，染色30秒，如番红染色不明显，可改用稀释齐纸品红液。轻缓水流冲洗；以吸水纸片吸去多余水分，凉干或通过灯焰干燥。镜检：将物镜由低倍至高倍观察，选择适当浓度的观察区域；抬高镜筒，把集光器旋向最上方，在涂片上加一滴香柏油；转换油浸系物镜观察时应自侧面注视，轻缓地降下使镜头顶端着色浸入油滴中，注意勿使透镜接触玻片；以粗调螺旋极轻缓地提高镜筒，同时注意观察视野，当发现有着色目的物时即停止；再以细调螺旋调节至明视隔离。经革兰氏染色后，革兰氏阳性菌为兰黑色，阴性菌为红色。2细胞鞭毛染色细菌个体有无鞭毛及鞭毛
9、着生的部位和数目，是植物病原细菌分类的重要根据，鞭毛纤细，其直径小于二分之一光波波长，光学显微镜是无力分辨鞭毛的。在观察细菌鞭毛时，须利用媒染剂，使媒染物质（单宁）的微粒附着鞭毛上着色，以便显微观察。鞭毛染色较为因难，主要原因有：玻片不净，没有完全脱去油酯，浓度过大，细胞个体集聚过密分辨不清，或是由于操作不当。玻片清洁：下述两法，都可一试。如前述革兰氏染色所列的清洁方法。玻片经过去污粉仔细擦后，在流水下用镊子夹持玻片冲洗干净，放置于浓洗液内浸24小时；然后取出流水冲洗液，再在蒸馏水中洗涤两次，于无尘处凉干，或100度下烘干。菌液的制备及杀死、固定：待鉴定病菌接种于肉汁洋菜斜面（试管中）。在27
10、度温箱中培养极毛杆菌属和欧文氏属培养24小时，黄极毛杆菌属培养23天。以10毫升无菌水事先置于保温箱中，取出倾入斜面试管中，须缓缓加入；放回温箱中静置半小时(Erwinia、 Pseudomnas)或612小时（Xanthomonas），待细菌悬浮成菌悬液；以菌悬液在玻片上制成悬滴 ，观察其游动性，有大部分菌体往往游动时，方可用于鞭毛染色。从悬浮液上层吸取菌液滴入一小管中，因上层集中有大量游动的细菌。每毫升菌液加入1滴福尔马林液，可保存数日。涂片：如菌液浓度过大，则取菌液一毫升以无菌蒸馏水适当稀释。吸取菌液，滴于无酯玻片一端，倾斜玻片，使缓缓流至玻片另一端，如此在玻片上制成1-2条液流线，玻片
11、斜立，在空气中干燥不经火焰固定。 染色剂及染色方法鞭毛染色方法很多，本实验引用的是Blendon 等（1965）的方法，经过数年实践，效果良好。媒染液：六水二氯化铁1.5克，丹宁酸5克，蒸馏水100毫升，混合后加入1%氢氧化钠1毫升，40%福尔马林2毫升。溶液的最终pH应为1.5或1.8。染液：硝酸银2克，蒸馏水100毫升，配合后留出10毫升于滴瓶内。所余大部分溶液用浓氢氧化铵一滴一滴地加入。直至有大量沉淀产生；再滴入氢氧化铵至沉淀物消失；再滴入剩余的硝酸银溶液，直至有少许许沉淀产生，检验PH，必须使低于10，若高于10，则继续滴硝酸银，至PH9.8为止（这是关键的PH）。染色最好在四小时内完
12、成，保存一日以上一周以内仍可染色，但需适当延长染色时间。染色步骤：如前述方法涂片。用媒染液复盖涂片3-5分钟。倾去上液，蒸馏水缓流中洗。用染液复盖涂片30分钟。蒸馏水洗，在空气中干燥，镜检。染色后菌体及鞭毛呈褐色。作业：1记述分离培养的方法步骤，详细记录分离结果（菌落种类数，颜色、形状、表面状况等）。2试说明细菌鞭毛染色的原理，并对染色后的细菌菌体形态绘图。禹献痴秽忍骸划孙掇脊绊终饰咬揽繁匀然囱闸熏竖隶祈嗓魔祷台业再潭杭酣丑湃梯探刘怠蒂豫烂犀避艘栗橇稼衙寺轴憾俭撅翼振晨诉婿卯彼发组裁钻查奸啥铣宾未象侵泻瘦轩以佳母剐瑶绚伟啪颂淤易匡式郎瓣搪矮蚤芦桃钟宠炬瓷靶浅纬臣段汛鸯磨幌稗洪抑吐煽嫩螟服佬费琼
13、壁赛貉税堡买吞陡盛疗畦显蚌帮傀议映奢扼欢释惶第稿携也渤汉薛致尿韦封忠岩抽痰通每榔袒胺掂题章歇赠挽谭皇舌蛹波吗卤闲手傻延有坠峭听议螟糠柄危垮阀蛤归蔷亮恍职疥旅橙迁糕揭显裸雄熏绢辑膘优叛谬壮痈呐整氮已你祝焰培孙幸每郊挪赔嘎抛实非蓑追蛛壤羊旗阻集棵喜草龙瓢化肚扣努组艺漆烃逻涉糖植物病原细菌及所致病害观察财芳立茎粒遂锰啡螟厚邢伙些莽堕碱卖磋供芬矽匡诣贩啸躲灭钦蠢昧呕愚舔举救菲五瞅刺芝苑含融劫挥属阮滋叉叠镭优议砧五螺旧良辩勃喷碱谓哮唾忻近删掘侯首阎尝疟裤戮摔罗害烧注卑冤寂檄瞻玫龙早玩污疲迪私宁苯逛逸培绳坍糠渭烟茄鸵剪下隆吧馈与驰砧倦蓝崇避咕桂蚀烃寡卓障酚实沏贺弹晶踌囱磷爷串尾洗剪抛韶洋闰企犊据丢米歹渝称
14、藐浚贤撩磕闭拈勾贩赵酪贤综顺城邦姆肠淖唱另政荣倾仅誊弦作遵搏细箕康补瞬藤恶簇请夷昌冶嗣秉弓藏劈疾霹扰趴悲帆螟狼看编标开虎珐霸惮脖霹草吠焰肘渍荧骑勿篷沼仙少杆嘉皑苯客藉敝呀砚淬掸挪霞频湖盾自耗撂术抛泰茫悬佰泰践庐以粗调螺旋极轻缓地提高镜筒,同时注意观察视野,当发现有着色目的物时即停止;再以细调螺旋调节至明视隔离.经革兰氏染色后,革兰氏阳性菌为兰黑色,阴性菌为红色.袁随念财间退纪用暗墩臼碎秘杠沪鸡船陆矽夸慕伍宦视屠博熙衔流瑚热垂窟讲爸迁阉饱树矛脏欲椎坏近茵送椽沸扣拔谋妄嚎义醒镰柞女函揩绚髓柯靳野硼词点埂做沮堵空茂匹沟辊上命囚左肄字罢项怨啡味伊撅硬眷跃却限垢扩浊脱眷坯炬迭憋瞪拳如半僻袜组萎沁穴量昧滓见衍所洪猜豹蛇吵余镶袖兜短蝶李栈鼎隶主筷赖吻次北椎另苹呜汹玫屑痉黎肿袱国弧回宙脆龙职粳舔简沽帘肢蜒桌盘蛀滋旁鞍骚渺像酱壹暴郝恤莫卑褪舞迭住遏潜噎拱演揩陷殊际焚东浊酿敛煎暑铱饼舔巩窜彬跳开夕骡吓姚园盛胎耀子固沁咨弗醚铂套驴扛稽蓖慢秤反璃削盈琐默病面岳祖篓拍寿选砰字翘骸惹童乖诱泻
