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1、 洁霉菌的紫外诱变摘要：洁霉菌的紫外诱变是利用紫外线的能量引起DNA结构发生变化，使邻近碱基对发生突变，形成的胸腺嘧啶二聚体，使DNA复制时发生错位造成蛋白质合成的错误，从而通过改变菌种的特性，再经过选育，从中找出性能优良的菌种，达到提高产量或质量的目的。本实验从孢子悬浮液开始，经过紫外诱变后，分离、纯化、发酵最终用杯碟法测出经诱变后的各菌种的效价。并通过与原菌种的效价相比，检验本实验所用诱变剂剂量对菌种效价提高的影响。关键词：紫外诱变 洁霉菌 抗生素 杯碟法 效价Abstract: Ultraviolet ray is microorganism strains of breeding a
2、kind of the most commonly used one of the mutagen, it use ultraviolet light energy cause DNA structure changes, base neighboring mutations, formation of thymine dimers, make DNA replication happens when dislocation of the protein synthesis by mistake, so as to change the characteristics of strains,
3、and then by selective breeding, find out the good performance of strains, improve the quality of the production or purpose. This experiment spore suspension from the start, after uv mutagenesis, separation, purification, fermentation and eventually use cups and saucers method by mutation of the meas
4、ure after the titer strains. And through the effect with the original strains than price, inspection this experiment used mutagen dose to the influence of the strains titer improve Key words:ultraviolet mutagenesis clean mold antibiotics cup dish method titer前言：紫外线是微生物菌种选育中最常用的一种诱变剂之一，在实验中我们常用15瓦的紫外
5、线灯管来处理菌种，因为此灯管照射的波长范围中253.7 A波长附近的光波比较多。此波长易被核酸吸收，因而诱变频率高。在处理菌种时常用死亡率的大小来间接了解诱变率的高低。因为菌种的死亡率和诱变率之间有一定的相应关系，而在实验中测出死亡率所用的时间比较短，能较早了解照射剂量是否适合，可及早调整。一般照射剂量与波长、照射距离、照射时间有关，所以可改变上述因素来调整照射剂量的大小，以达到较大的诱变率，提高得到高产菌种的机率。本实验固定波长（用15瓦灯管）、固定照射距离(30cm)，通过不同的照时间（2040秒）的处理，最后视其效果。学会用生物效价测定法中的杯碟法测定洁霉素的效价。一、实验目的与要求 掌
6、握洁霉菌紫外诱变技术的全程操作，包括消毒仪器器皿、配置培养基等准备工作、诱变、分离、培养等。本实验为设计型实验，学生在老师的指导下自行选择紫外诱变时间。整个实验分五次完成，历时五周。实验报告以论文形式提交，要求在五千字以上、装订成册，并提交电子版。二、实验原理 紫外线是微生物菌种选育中最常用的一种诱变剂之一，它利用紫外线的能量引起DNA结构发生变化，使邻近碱基对发生突变，形成的胸腺嘧啶二聚体，使DNA复制时发生错位造成蛋白质合成的错误，从而改变菌种的特性，再经过选育，从中找出性能优良的菌种，达到提高产量或质量的目的。本实验从孢子悬浮液开始，经过紫外诱变后，分离、纯化、发酵最终用杯碟法测出经诱变
7、后的各菌种的效价。并通过与原菌种的效价相比，检验本实验所用诱变剂剂量对菌种效价提高的影响。三、实验过程第一次实验 1实验目的： 为诱变实验作准备，学会培养基的配制。2材料与仪器 （1）玻璃仪器：250ml三角瓶：15*150试管12只；双碟：直径9cm10个：直径5cm1个：涂布棒2只：lml或2ml吸管12只：5ml吸管1只。（2） 洁霉菌平板分离培养基配方：可溶性淀粉 2， KNO3 0.1，K2HPO4 3H2O 0.05%，MgSO4 7H2O 0.05%，NaCL 0.05，FeSO4 7H2O 0.001%。 琼脂 1 ， pH 7.2。其余为蒸馏水。3、实验步骤：(1) 按上述培
8、养基配方配制250毫升分离培养基，分装到二只三角瓶中。每瓶100毫升，剩余部分装到4支试管中，每支4毫升左右，待消毒后做成斜面。(2) 在12支试管中分别加4.5毫升蒸馏水。(3) 将9cm的碟子(每人8-10个)、5cm的碟子1个（含转子）、涂布棒2只、移液管(塞好棉花)等均经高温灭菌后备用。第二次实验 1、实验目的：掌握紫外诱变育种的操作技术并通过实验计算出不同照射时间的死亡率。2、实验原理：紫外线处理菌种的原理在前面已叙述，在实验中我们常用15瓦的紫外线灯管来处理菌种，因为此灯管照射的波长范围中253.7 A波长附近的光波比较多。此波长易被核酸吸收，因而诱变频率高。在处理菌种时常用死亡率
9、的大小来间接了解诱变率的高低。因为菌种的死亡率和诱变率之间有一定的相应关系，而在实验中测出死亡率所用的时间比较短，能较早了解照射剂量是否适合，可及早调整。一般照射剂量与波长、照射距离、照射时间有关，所以可改变上述因素来调整照射剂量的大小，以达到较大的诱变率，提高得到高产菌种的机率。本实验固定波长（用15瓦灯管）、固定照射距离(30cm)，通过不同的照时间（2040秒）的处理，最后视其效果。3、材料与仪器： （1）紫外照射箱：装有15瓦紫外灯管以及磁力搅拌器，并带有可供样品进出口的封闭的装置。灯管与磁力搅拌器的距离(即照射距离)为30 cm。 （2）玻璃仪器；碟子直径9cm的双碟：直径5cm的双
10、碟1副(内有一根外套玻璃管的铅丝作为搅拌子)；lml吸管； 5ml吸管；涂布棒(上述仪器均已消毒)。（3）洁霉菌单孢子悬浮液(由教师制备好)制备方法如下：取已培养好的洁霉菌孢子斜面500ml的扁瓶一只，加入40ml无菌水，把孢子轻轻括下，将其倒入已灭菌盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡20分钟，用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤，即得分散较好的单孢子悬浮液。（4）已灭菌的洁霉菌平板分离培养基，100m1。（5）装有4.5ml无菌水的试管12支。4实验步骤：(1) 倒平板：在直径为9 cm的碟子中每只倒入20 ml左右分离培养基；，放平，盖上上盖，注意留出缝隙以便放出蒸汽。冷却后备用。(2) 紫外线照射；吸取单
11、孢子悬浮液5ml于已灭菌的直径为5 cm的碟子中，进行紫外线照射。照射时间为实验同学自行设计。将装有菌液的碟子放入紫外箱中。接通电磁搅拌器电源，缓缓将电磁搅拌器转速调整至能够搅拌充分即可，防止搅拌速度过快使菌液溅出。使然后打开碟子盖，最后将紫外灯打开，开始计时。照射结束，关闭紫外线灯，先将碟子盖上，再从紫外箱中取出。(3) 稀释：从照射碟子中吸取0.5ml菌液， 加入4.5ml的无菌水中， 摇匀(作为-1，次方)，依次稀释到所需浓度。本实验对照未经照射的原菌液)稀释至105 、106次方：照射30秒的稀释至104、105次方：照射40秒的稀释至103、104次方。(4) 分离：将上述稀释好的最
12、后二个浓度的液体，分别吸取0.1ml放入培养基已冷却凝固的碟子中，每个浓度做23个碟子，然后用涂布棒将菌液均匀涂遍整个碟子，先涂低浓度的，后涂高浓度的，最后将碟子倒置放入28培养箱中，培养57天。(5) 计数：培养57天后计数。在所培养的碟子中选菌落数适中的碟子计数，并计算出某一稀释度的碟子中的菌落平均数。(6) 计算出不同照射时间的死亡率：死亡率（对照组菌落数处理后的菌落数）/ 对照组菌落数100注：菌落数的计算：将同一稀释度的几个碟子中菌落的平均数 稀释倍数10，（因为在涂碟子时每个碟子只吸取01m1）即为此稀释度的菌浓度(个亳升)。今天的实验均要求无菌操作。第三次实验1实验目的与内容：将
13、已培养好的碟子取出计数，计算出死亡率，将分离碟子中的单菌落挑入斜面。为下一次实验配好发酵培养。2材料与仪器：（1）玻璃仪器：250ml三角瓶；已消毒好的斜面；接种针（2）发酵培养基的配方：葡萄糖 10， 淀粉 2，黄豆饼粉 2.5，玉米浆 0.2，(NH4)2SO4 0.2，NH4NO3 0.2，NaCl 0.5，NaN03 0.8%，KH2PO4 0.025%，CaCO3 0.8%，pH 7.07.5。3实验步骤：(1) 计数：将碟子中的洁霉菌菌落的个数一一数出，此原始数据用表格表示出。(2) 挑斜面：将生长好的、孢子丰满的、没有染菌的单菌落用接种针挑入斜面，放入培养箱培养7天。操作过程要求
14、严格无菌。对照菌种挑二支，处理菌种挑三支。(3) 配发酵培养基：先按150ml培养基的量计算出各成分的用量，配制过程中要注意淀粉要先糊化再和别的成分混合。无机盐要用热水溶解后再混合，CaC03要调好PH后再加入。培养基配好后分装到250ml的三角瓶中，每个瓶装有25ml(要用漏斗加入以免弄脏瓶口)，引起染菌，装好后用八层纱布塞住瓶口，并用牛皮纸扎紧，以备消毒。第四次实验1、实验目的接发酵摇瓶；配制效价培养基。2、实验仪器(1) 旋转式摇床一台，其转速为230转/分。(2) 已消毒好的发酵培养基4瓶。(3) 250ml三角瓶、150ml三角瓶。(4) 生物效价培养基配方：蛋白胨 0.6 ，酵母膏
15、 0.6，牛肉膏 0.15，葡萄糖 0.1，pH 7.88.0，琼脂 1.6%（上层培养基 0.7%，下层培养基 0.9%）。3、实验步骤（1）接发酵摇瓶：在无菌条件下，将培养好的洁霉菌斜面挖一小块接入已灭菌好的发酵培养基中，在28、旋转式摇床上培养7天。对照菌种接一只摇瓶，处理菌种接三只摇瓶。（2）效价培养基配制：效价培养基共配150 ml，按体积计算好各组分，称取各用量（除琼脂外），溶解后稀释至150 ml，然后用NaOH调pH。配好后分装二个瓶：在250 ml三角瓶中加入80 ml培养基（作为下层培养基），然后再加入所需琼脂；在150 ml三角瓶中加入50 ml培养基（作为上层培养基），
16、并加入所需琼脂。第五次实验1、实验目的学会用生物效价测定法中的杯碟法测定洁霉素的效价。2、实验原理抗生素在琼脂层中的扩散作用和抗生素对试验菌有抑制菌体生长的作用，将抗生素放入带有试验菌的琼脂双碟中培养，在抗生素扩散浓度达到抑菌浓度的地方就会产生透明的抑菌圈，将已知标准溶液与未知效价的被检样品溶液，在同一碟子中(即培养条件相同)进行培养，18小时后测定抑菌圈大小，将测得的抑菌圈直径数值代入公式即可计算出样品的效价。 本实验采用两剂量法，为了把球面扩散公式运用于实验，因此设定了几个参数，并通过一定的推导得到一个所有参数均可通过实验测得的公式，以便计算。首先将标准品和被测样品均稀释成两个剂量，分别称
17、之为标准品高浓度(M)；标准品低浓度(m)：被测样品高浓度(M)；样品低浓度(m)（后二个浓度是估计浓度），设定在这些浓度下其相应的抑菌圈的直径分别为(SH)、(SL)、(UH)和(UL)。把这些参数分别代入球面扩散公式，然后通过一系列的推导得到如下公式：样品浓度与标准晶浓度的百分数。 K高低浓度之比，本实验设定为2。V=( UH + UL )( SH + SL ) W = ( UH + SH )(UL+SL)求出后再计算单位，实际单位=*估计单位3、材料与仪器（1）试验菌种：滕黄八叠球菌 （2）玻碎器皿：直径为9 cm的碟子；不锈钢管(外径8 0.1 mm；内径6 01 mm；高10 01
18、mm )吸管1ml；粗口吸管15 ml、5 ml各一支；陶瓷瓦盖；滴管；镊子。（3）洁霉素标准溶液效价为5 uml和2.5 uml的各5 ml。（4）已培养好的洁霉菌发酵摇瓶。4、实验步骤(1) 标准试验菌的准备：标准试验菌种为滕黄八叠球菌，系中央生物制品所购入的冷冻干燥管，保存在4冰箱内，使用时以无菌操作接种于培养基斜面上，于37培养24小时后， 保存于4冰箱中作为工作菌种(每周移一次)。本实验用4只茄子瓶（500ml）斜面，用12ml生理盐水洗下，再用灭菌玻璃珠打散，做成菌悬浮液。(这一步由教师制作)(2) 放瓶：将培养好的发酵摇瓶从摇床上取下，并进行外观检查，看其颜色，pH、气味、稠度等
19、，以初步判断摇瓶生长情况及是否染菌，要求用表格形式完成详细记录。(3) 发酵液过滤：用漏斗和滤纸过滤，注意不要将滤纸事先用水湿润。稀释样品：样品估计单位500 u/ml，用无菌去离子水将样品稀释至5 u和2.5 u备用。(4) 底层的制备：将下层培养基用大口吸管吸15 ml至碟子中，水平放置于桌子上冷却备用。(5) 菌层的制备：将上层培养基冷却至60左右，加入0.7的实验菌，摇匀后在已冷却好的下层培养基上加5 ml上层培养基，迅速摇匀，注意一定要铺得非常均匀，使碟子中的培养基厚度一致，冷却后备用。（6）钢圈的加入：先在培养基已完全冷却好的碟子背后用记号笔按下图1-1写好标记。再用摄子轻轻将钢圈
20、按图中位置放在培养基上，千万不能让钢圈陷入培养基中。按图中的标样分别滴入标准品和被测样品的高低单位，滴满为止，要保持每个钢圈内的液体量相同，然后盖上瓦盖，小心地将碟子放入37培养箱中培养，18小时后将碟子取出，倒出钢圈，即可量取抑菌圈大小。图1-1 钢圈布置示意图四、 数据处理1、菌落形态及个数形态个数照射组1不均匀菌落稀少，孢子较小分布9271菌落少，孢子较小分布不均匀525对照组12轻度染菌，分布均匀，丰满健壮1412用以上表格数据可知 照射组菌落数=（9+7）/210=8（个） 对照组菌落数=（12+14）/210=13（个） 死亡率=(对照组菌落数-照射组菌落数)/ 对照组菌落数100
21、% =(13-8)/13100%=38.46%比较 组别颜色气味粘度挂壁PH生长情况染菌对照组土黄色土腥味较稠良好7.0良否土黄色土腥味较稠良好7.5良否诱变组土黄色微酸较稀不好5.5差是土黄色微酸较稀不好5.5差是2、抑菌圈的直径对照组实验组U(cm)2.02.1U(cm)2.02.0S(cm)2.62.5S(cm)2.31.8将测得的抑菌圈直径数值代入公式即可计算出样品的效价：对照组：V=（UH+UL）-（SH+SL）=（2.0+2.0）-（2.6+2.3）=-0.9 W=（UH+SH）-（UL+SL）=（2.0+2.6）-（2.0+2.3）=0.3 =kV/W =0.125实际单位*估计
22、单位=0.125500=62.5实验组：V=（UH+UL）-（SH+SL）=（2.1+2.0）-（2.5+1.8）=-0.2 W=（UH+SH）-（UL+SL）=（2.1+2.5）-（2.0+1.8）=0.8 =kV/W =0.8414实际单位=*估计单位=0.8414500=420.7对照组实际单位诱变组实际单位五、 结果与讨论通过对抑菌圈平板的观察可以初步判定本实验是成功的，紫外照射后对洁霉菌进行筛选通过对比发现经过照射的菌种产生抗生素的能力有明显提高抑菌圈明显比对照组的抑菌圈大。本实验非常重要的一项就是无菌操作，防止染菌,无菌操作的关键是培养基、实验仪器灭菌彻底，操作在无菌室或酒精灯旁边
23、。实验过程中移取溶液、稀释过程快、涂布过程均、转子转速均匀等操作易产生实验误差。但是在试验过程中这方面明显做的不够好种子液有明显的染菌现象，对实验结果有很大的影响。洁霉菌为好氧菌，在培养时需要足够氧气，摇床培养能增加氧气溶量，利于菌体有效地利用培养基。在摇瓶培养的过程中对氧气的需求量较大，所以一般选用纱布包起来，因为纱布的透气性比棉塞效果好9。此次实验，让我更加的明白做我们微生物实验的人，应该时刻注意染菌问题，因为这对实验非常重要，也是我们做微生物实验的人时刻注意的，同时它也体现我们的专业素养。参考文献1李力群，闫丽萍，杨梅.生物工程专业实验指导书吉林化工学院；2010,6 7-14.2季惠军
24、，范毅颖，郑国香，紫外线与亚硝酸复合诱变在顶头孢霉菌选育中的应用 ，中国科学院上海冶金研究所; 材料物理与化学(专业) 博士论文 ；2000. 3Shima S，Sakai H.Polylysine produced by StreptomycesJ.Agric Biol Chem，1977，41(9):1907-1909.4 范秀容.微生物学实验室.北京：高等教育出版社，1980.82-875 北京大学生物系生物化学教研室1 生物化学实验指导,北京:高等教育出版社,1979 ,pp. 2032056 陈丽荣, 高仲森. 洁霉菌半光秃型高产菌株的选育J. 中国抗生素杂志, 1985,(02)7 邬建国,王敏,杨东靖,杜连祥. 高产纳他霉素的褐黄孢链霉菌选育J中国抗生素杂志, 2004,(06) . 8 娄忻,张莉,刘靓,张玉莲,陈丽华,刘静,贺建功. 青霉素高产菌株的理性筛选J. 中国抗生素杂志, 2007,(07) . 9陈耀鸿林可霉素类抗生素国外资料综述 J . 国外药学抗生素分册, 1981, 2 (4) : 4445.
